段永強(qiáng)　鞏子漢　王麗園　成映霞　王強(qiáng)　楊曉軼　李蘭珍　段云燕

摘要：目的??觀察香砂六君子湯對(duì)慢性萎縮性胃炎（CAG）大鼠胃組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、磷酸酶張力蛋白同源物基因（PTEN）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）的影響，探討該復(fù)方防治CAG的作用機(jī)制。方法??將120只Wistar大鼠分為空白組和模型組，采用綜合法制作CAG動(dòng)物模型，將成模大鼠分為模型組、維酶素組和香砂六君子湯高、中、低劑量組，空白組和模型組大鼠給予10?mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，香砂六君子湯高、中、低劑量組分別給予24、12、6?g/（kg·d）香砂六君子湯灌胃，維酶素組給予0.30?g/（kg·d）維酶素灌胃，連續(xù)120?d。ELISA檢測(cè)大鼠胃組織VEGF含量，RT-PCR和Western?blot分別檢測(cè)大鼠胃組織PTEN、PI3K、AKT基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果??與空白組比較，模型組大鼠一般狀況較差，胃黏膜變薄，上皮細(xì)胞及腺體排列紊亂、稀疏，腺體數(shù)目明顯減少，黏膜肌層增厚向固有層延伸，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胃組織PTEN基因及蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01），VEGF含量和AKT、PI3K基因及蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，香砂六君子湯高劑量組大鼠胃組織PTEN基因表達(dá)顯著升高（P<0.01），VEGF含量和AKT、PI3K基因及蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）。結(jié)論??香砂六君子湯通過(guò)改善模型大鼠生存狀況及胃黏膜病理狀態(tài)，上調(diào)胃組織PTEN表達(dá)，下調(diào)VEGF、AKT、PI3K表達(dá)，發(fā)揮治療CAG的作用。

關(guān)鍵詞：慢性萎縮性胃炎;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;磷酸酶張力蛋白同源物基因;磷脂酰肌醇3-激酶;蛋白激酶B;香砂六君子湯;大鼠

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????文章編號(hào)：1005-5304（2020）03-0033-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201907062

Effects?of?Xiangsha?Liujunzi?Decoction?on?PI3K?Signaling?Pathway?Correlation?Factor?Expression?in?Gastric?Tissue?of?Rats?with?Chronic?Atrophic?Gastritis

DUAN?Yongqiang1，2，3，4，?GONG?Zihan1，3，?WANG?Liyuan1，5，?CHENG?Yingxia1，?WANG?Qiang1，?YANG?Xiaoyi1，?LI?Lanzhen1，?DUAN?Yunyan1

1.?Gansu?University?of?Chinese?Medicine，?Lanzhou?730000，?China;?2.?Gansu?Key?Laboratory?of?Pharmacology?and?Toxicology?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Lanzhou?730000，?China;?3.?Key?Laboratory?of?Traditional?Chinese?Herbs?and?Prescription?Innovation?and?Transformation?of?Gansu?Province，?Lanzhou?730000，?China;?4.?Key?Laboratory?of?Dunhuang?Medicine?and?Transformation?of?Ministry?of?Education，?Lanzhou?730000，?China;?5.?Cangxi?County?Traditional?Chinese?Medicine?Hospital，?Cangxi?628400，?China

Abstract：?Objective?To?observe?the?effects?of?Xiangsha?Liujunzi?Decoction?on?vascular?endothelial?growth?factor?（VEGF），?phosphatase?tensin?protein?homologue?（PTEN），?phosphatidylinositol?3-kinase?（PI3K）?and?protein?kinase?B?（AKT）?in?gastric?tissue?of?rats?with?chronic?atrophic?gastritis?（CAG）;?To?discuss?the?mechanism?of?this

compound?for?prevention?and?treatment?of?CAG.?Methods?Totally?120?SPF?Wistar?rats?were?randomly?divided?into?blank?group?and?model?group.?CAG?animal?models?were?reproduced?by?comprehensive?method.?The?model?rats?were?randomly?divided?into?model?group，?vitacoenzyme?tablets?group?and?Xiangsha?Liujunzi?Decoction?high-，?medium-?and?low-dosage?groups.?The?blank?group?and?model?group?were?given?10?mL/（kg·d）?distilled?water?for?gavage，?and?Xiangsha?Liujunzi?Decoction?high-，?medium-?and?low-dosage?groups?were?given?24?g/（kg?d），?12?g/（kg?d），?and?6?g/（kg·d）?Xiangsha?Liujunzi?Decoction，?respectively，?for?gavage.?Vitacoenzyme?tablets?group?was?given?0.30?g?/?（kg·d）?vitacoenzyme?tablets，?for?consecutive?120?d.?The?content?of?VEGF?in?gastric?tissue?was?detected?by?ELISA，?and?the?gene?and?protein?expressions?of?PI3K，?PTEN?and?AKT?were?detected?by?RT-PCR?and?Western?blot，?respectively.?Results?Compared?with?the?blank?group，?the?general?survival?condition?of?the?model?group?was?worse;?the?gastric?mucosa?of?the?model?group?was?thinner，?the?arrangement?of?epithelial?cells?and?glands?was?disordered?and?sparse，?the?number?of?glands?was?significantly?reduced，?the?muscular?layer?of?the?mucosa?was?thicker?and?extended?to?the?lamina?propria，?a?large?number?of?inflammatory?infiltration?could?be?seen，?PTEN?gene?and?protein?expression?in?gastric?tissue?were?significantly?reduced?（P<0.01），?and?the?content?of?VEGF?and?the?gene?and?protein?expressions?of?AKT?and?PI3K?in?gastric?tissues?significantly?increased?（P<0.01）.?Compared?with?model?group，?the?gene?expression?PTEN?in?gastric?tissue?of?rats?in?Xiangsha?Liujunzi?Decoction?high-dosage?group?was?significantly?higher?（P<0.01），?and?the?content?of?VEGF?and?gene?and?protein?expressions?of?AKT?and?PI3K?in?gastric?tissues?significantly?decreased?（P<0.01）.?Conclusion?Xiangsha?Liujunzi?Decoction?can?exert?the?therapeutic?effect?on?CAG?by?improving?the?general?survival?of?the?model?rats?and?the?pathological?state?of?gastric?mucosa，?up-regulating?the?expression?of?PTEN?in?gastric?tissue，?down-regulating?the?expression?of?VEGF，?AKT?and?PI3K.

Keywords：?chronic?atrophic?gastritis;?vascular?endothelial?growth?factor;?PTEN;?PI3K;?AKT;?Xiangsha?Liujunzi?Decoction;?rats

慢性萎縮性胃炎（chronic?atrophic?gastritis，CAG）多因素體脾胃虛弱、飲食不節(jié)、情志失調(diào)、感受外邪導(dǎo)致中焦氣機(jī)不利、升降失司而引發(fā)，常表現(xiàn)出胃脘痞滿(mǎn)、疼痛、納呆、噯氣、大便不調(diào)、消瘦等癥狀。諸多醫(yī)家經(jīng)長(zhǎng)期臨床觀察總結(jié)認(rèn)為，CAG病位在脾胃，其病機(jī)關(guān)鍵是脾胃虛弱。脾主升清，胃主通降，脾胃為一身氣機(jī)升降之樞紐，若脾胃受損，脾失健運(yùn)，胃失和降，則中焦氣機(jī)紊亂，氣血生化乏源，臟腑失養(yǎng)而致胃痞[1-3]。正如《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集》所云：“脾不能行氣于肺胃，結(jié)而不散則為痞?！迸R床應(yīng)用香砂六君子湯治療CAG療效顯著[4]，且本課題組前期研究表明，香砂六君子湯可調(diào)控CAG大鼠NF-κB通路進(jìn)而抑制炎癥因子白細(xì)胞介素（IL）-12、腫瘤壞死因子-α、IL-1β和IL-8的高表達(dá)，改善CAG大鼠胃排空功能、促進(jìn)胃蛋白酶活性、下調(diào)缺氧環(huán)境缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α基因和蛋白表達(dá)，調(diào)控IL-6、IL-10及熱休克蛋白70基因及蛋白表達(dá)，對(duì)CAG大鼠胃竇黏模具有保護(hù)作用[5-7]。有研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）參與腫瘤的進(jìn)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，其高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展有關(guān)[8]。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、增生、遷移、分化和代謝[9]。PI3K/AKT信號(hào)通路與胃上皮細(xì)胞的增殖和凋亡關(guān)系密切，胃上皮細(xì)胞增殖過(guò)度而凋亡不足時(shí)，則可能導(dǎo)致胃癌的發(fā)生[10]。本研究旨在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察以健脾理氣和胃法為指導(dǎo)的香砂六君子湯對(duì)CAG大鼠生存狀況、胃組織VEGF、磷酸酶張力蛋白同源物基因（PTEN）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）表達(dá)的影響，探討該復(fù)方防治CAG的作用機(jī)制。

1??材料與方法

1.1??動(dòng)物

SPF級(jí)健康Wistar大鼠120只，雌雄各半，2月齡，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，相對(duì)濕度45%～55%，室溫（23±2）℃，自由攝食飲水。

1.2??藥物

香砂六君子湯（生曬參、茯苓、麩炒白術(shù)、姜半夏、木香、砂仁、陳皮、甘草、生姜），飲片均購(gòu)自蘭州復(fù)興厚藥材有限責(zé)任公司。生曬參、麩炒白術(shù)、茯苓、陳皮、姜半夏、砂仁、木香、生姜、甘草按6∶12∶12∶5∶6∶5∶4∶12∶4比例配制[11]。加10倍蒸餾水浸泡2?h后常規(guī)煎煮1?h，濾出藥渣，保存藥液，藥渣再加8倍蒸餾水煎煮45?min，混合2次藥液，常壓下濃縮至1?mL藥液含原藥材2?g。置于4?℃冰箱保存，使用時(shí)稀釋至所需濃度。維酶素片，新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，批號(hào)20160518;MNNG，梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)75F7I-TF;雷尼替丁，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)151101。

1.3??主要試劑與儀器

VEGF酶聯(lián)免疫試劑盒，上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司，批號(hào)201811;總RNA抽提試劑Trizol，美國(guó)Life?Technologies公司，批號(hào)152104;PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國(guó)Promega公司，批號(hào)00435083;實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒，美國(guó)Promega公司，批號(hào)0000227638;彩虹Marker，北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)00580081;GAPDH，美國(guó)Gene?Tex公司，批號(hào)130201;Ant-PTEN?Antibody，美國(guó)Abcam公司，批號(hào)GR62840-23;Ant-pan-AKT?Antibody，美國(guó)Abcam公司，批號(hào)GR3192605-11;Ant-PI3K?antibody，美國(guó)Abcam公司，批號(hào)GR3192684-9;IgG（H+L），美國(guó)Immunoway公司，批號(hào)B0201。VELOCITY?18R高速臺(tái)式低溫離心機(jī)（澳大利亞Dynamically公司），XYJ80-2離心機(jī)（廣東塘廈駿越機(jī)電設(shè)備廠），BIOMATE?3S核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)BIO-RAD），S1000TM反轉(zhuǎn)錄儀（美國(guó)Bio-Rad），CFX96TM?Optics?Module?PCR儀（美國(guó)Bio-Rad），HH-4數(shù)顯恒溫水浴箱（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所），JY-SPAT電泳槽（美國(guó)Bio-Rad），Chemi?DOC?XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad），電子計(jì)時(shí)器（Gene?Tex）。

1.4??造模

大鼠給予常規(guī)飼料及雙蒸水適應(yīng)性飼養(yǎng)7?d，按隨機(jī)數(shù)字表法將120只大鼠分為空白組（20只）和造模組（100只）。每日8：00空白組大鼠給予1?mL/100?g生理鹽水灌胃，每日9：00給予定量維持飼料，給予雙蒸水供大鼠每日自由飲用。造模組大鼠參照文獻(xiàn)[12]方法，采用綜合法造模。①使用DMSO作為溶劑，將MNNG固體溶解，配制成20%MNNG溶液，置于4?℃冰箱避光保存;②將配制好MNNG溶液與水按1∶2000比例配制，給予大鼠自由飲用，大鼠飲水瓶采用錫箔紙包裹避光;③將雷尼替丁溶解于85%NaCl溶液當(dāng)中，按0.03?g/kg大鼠體質(zhì)量灌胃;④采用饑飽失常喂養(yǎng)法：2?d足量喂養(yǎng)，1?d禁食不禁水。連續(xù)造模16周。待大鼠CAG造模8周后，2周為1個(gè)周期，隨機(jī)抽取大鼠，取大鼠胃組織做病理檢查，評(píng)價(jià)CAG模型復(fù)建是否成功。

1.5??分組及給藥

造模16周后病理切片顯示CAG大鼠模型成功，按隨機(jī)數(shù)字表法將成模大鼠分為模型組、維酶素組和香砂六君子湯高、中、低劑量組，每組16只。模型組和空白組每日按10?mL/kg蒸餾水灌胃，維酶素組每日按0.30?g/kg維酶素灌胃（相當(dāng)于60?kg成人每日劑量的6倍），香砂六君子湯高、中、低劑量組每日按24、12、6?g原藥材/kg灌胃（相當(dāng)于60?kg成人每日劑量的12、6、3倍）。等效劑量按人與動(dòng)物體型系數(shù)折算，給藥體積2?mL/100?g，每日1次，連續(xù)120?d。

1.6??標(biāo)本采集與檢測(cè)

大鼠于末次灌胃后禁食不禁水24?h，10%水合氯醛麻醉脫臼處死大鼠，解剖，取出胃組織，沿胃大彎剪開(kāi)，生理鹽水漂洗去除胃內(nèi)容物。部分組織存放于4%多聚甲醛以備后續(xù)HE染色行病理組織學(xué)評(píng)估;另一部分置凍存管中，立即放入-80?℃超低溫冷凍冰箱備用，以備后續(xù)采用RT-PCR和Western?blot分別檢測(cè)大鼠胃組織PTEN、PI3K、AKT基因及蛋白表達(dá)。

1.7??ELISA檢測(cè)大鼠胃組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子含量

將試劑盒和待測(cè)血清平衡至室溫，稀釋準(zhǔn)備對(duì)照品和洗滌液，按要求加樣、溫育、洗滌、溫育、洗滌、顯色、終止，酶標(biāo)儀測(cè)定450?nm波長(zhǎng)處各孔吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣品濃度。嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.8??RT-PCR檢測(cè)大鼠胃組織磷酸酶張力蛋白同源物基因、磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B基因表達(dá)

采用Trizol法提取總RNA，測(cè)定其OD260/OD280均在1.8～2.0，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增PTEN、PI3K、AKT基因片段。引物設(shè)計(jì)：從NCBI基因庫(kù)中查詢(xún)目標(biāo)基因ID及序列，引物由TAKARA公司寶生物工程大連有限公司設(shè)計(jì)和合成。β-Actin引物序列：上游5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度150?bp;PTEN引物序列：上游5'-CCAATGGCTA?AGTGAAGACGACAA-3'，下游5'-CATAGCGCCT?CTGACTGGGAATA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度197?bp;PI3K引物序列：上游5'-CTGGAGAGCTTGGAGG?ACGA-3'，下游5'-TCGCAAGAACCAGAATAAGAAGTG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度159?bp;AKT引物序列：上游5'-ATGGACTTCCGGTCAGGTTCA-3'，下游5'-GCCC?TTGCCCAGTAGCTTCA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度126?bp。本實(shí)驗(yàn)選擇β-actin作為內(nèi)參基因，同一種基因在模板進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，每次平行試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，記錄目的基因和β-actin的Ct值。運(yùn)用ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，檢測(cè)β-Actin及目的基因Ct值。ΔCt1=測(cè)試組目的基因Ct值-測(cè)試組β-actin?Ct值，ΔCt2=對(duì)照組目的基因Ct值-對(duì)照組β-actin?Ct值，ΔΔCt=ΔCt1-ΔCt2，相對(duì)表達(dá)量為2-ΔΔCt。

1.9??Western?blot檢測(cè)大鼠胃組織磷酸酶張力蛋白同源物基因、磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B蛋白表達(dá)

使用RIPA法提取胃組織蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。GAPDH?Antibody溶液配制（1∶1000）：GAPDH?Antibody?10?μL，封閉液10?mL;AKT?Antibody溶液配制（1∶500）：AKT?Antibody?20?μL，封閉液10?mL;PTEN?Antibody溶液配制（1∶1000）：PTEN?Antibody?10?μL，封閉液10?mL;PI3K?Antibody溶液配制（1∶1000）：PI3K?Antibody?10?μL，封閉液10?mL。37?℃搖床4?h，1×TBST洗滌3次×10?min，加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗。HRP*Goat?AntiRabbit?IgG（H+L）溶液配制（1∶1000）：HRP*Goat?AntiRabbit?IgG（H+L）10?μL，封閉液10?mL;37?℃搖床2?h，1×TBST洗滌3次×10?min，采用化學(xué)發(fā)光底物化學(xué)發(fā)光，暗室曝光顯影后用Quantityone圖像分析軟件進(jìn)行掃描分析。

1.10??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，組間均數(shù)比較用方差分析，方差齊用S-L-D法比較，方差不齊用Tamhane's?T2法比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??一般狀況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中空白組大鼠精神狀態(tài)好，反應(yīng)靈敏，被毛順滑有光澤，大便以棕褐色質(zhì)軟顆粒為主;造模第6周后，造模組大鼠開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡，攝食量減少，倦怠扎堆，反應(yīng)遲鈍，被毛雜亂無(wú)光澤易脫落等，隨著造模的延續(xù)，大多數(shù)大鼠表現(xiàn)為弓背彎曲、瞇眼蜷縮、消瘦昏睡、厭食怠動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、被毛稀疏枯槁無(wú)光澤、大便量少質(zhì)干或便溏，總體生存狀態(tài)較差。藥物治療階段，空白組大鼠一般狀況良好，體型逐漸增大;模型組大鼠精神萎靡、厭食倦怠、反應(yīng)遲鈍、消瘦嗜睡、皮毛枯槁無(wú)光澤;香砂六君子湯高劑量組上述表現(xiàn)逐漸減輕，治療10周后香砂六君子湯高劑量組大鼠精神狀態(tài)基本恢復(fù)正常，活動(dòng)及攝食量正常，反應(yīng)較為靈敏，被毛疏散但有光澤;香砂六君子湯中劑量組及維酶素組大鼠上述表現(xiàn)均有不同程度改善，但恢復(fù)相對(duì)緩慢;而香砂六君子湯低劑量組大鼠無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，僅少量較模型組大鼠癥狀有所緩解。

2.2??胃組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

空白組大鼠胃黏膜各層結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞及腺體排列規(guī)整，大小及形狀較一致，黏膜固有層炎性細(xì)胞少見(jiàn);模型組大鼠胃黏膜變薄，上皮細(xì)胞及腺體排列紊亂、稀疏，腺體數(shù)目明顯減少，黏膜肌層增厚向固有層延伸，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);維酶素組大鼠胃黏膜較薄，腺體排列欠整齊，腺體數(shù)目減少，可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，較模型組有所好轉(zhuǎn);香砂六君子湯高劑量組大鼠胃黏膜各層結(jié)構(gòu)基本正常，腺體排列比較規(guī)整，間質(zhì)有少許炎性細(xì)胞;香砂六君子湯中劑量組大鼠胃黏膜腺體排列比較規(guī)整，各層結(jié)構(gòu)較為正常，可見(jiàn)少量腺體變形萎縮及炎性細(xì)胞;香砂六君子湯低劑量組大鼠胃黏膜較薄，腺體數(shù)目減少，排列紊亂，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1??各組大鼠胃組織形態(tài)（HE染色）

2.3??香砂六君子湯對(duì)模型大鼠胃組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃組織VEGF含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠胃組織VEGF含量均有降低趨勢(shì)，其中，香砂六君子湯高、中劑量組大鼠胃組織VEGF含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1??各組大鼠胃組織VEGF含量比較（x（—）±s）

注：與空白組比較，**P<0.01;與模型組比較，△△P<0.01

2.4??香砂六君子湯對(duì)模型大鼠胃組織磷酸酶張力蛋白同源物基因、磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B?mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃組織PTEN?mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)顯著降低，PI3K、AKT?mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠胃組織PTEN?mRNA及蛋白表達(dá)均有升高趨勢(shì)，PI3K、AKT?mRNA及蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì)，其中香砂六君子湯高、中劑量組大鼠胃組織PTEN?mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高，高劑量組大鼠胃組織PI3K、AKT?mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。

表2??各組大鼠胃組織PTEN、PI3K、AKT基因及蛋白表達(dá)比較（x（—）±s）

注：與空白組比較，**P<0.01;與模型組比較，△△P<0.01

注：K.空白組;M.模型組;W.維酶素組;G.香砂六君子湯高劑量組;Z.香砂六君子湯中劑量組;D.香砂六君子湯低劑量組

圖2??各組大鼠胃組織PTEN、PI3K、AKT蛋白免疫印跡圖

3??討論

香砂六君子湯作為治療脾胃虛弱，濕濁內(nèi)生，氣機(jī)不通經(jīng)典方藥，遵循“健脾理氣和胃”治療原則。香砂六君子湯出自《古今名醫(yī)方論》[13]，由六君子湯加木香、砂仁而成，用于治療脾胃氣虛、痰阻氣滯證。方中以大補(bǔ)元?dú)狻⒀a(bǔ)脾益氣之人參為君;臣以白術(shù)健脾燥濕、助脾運(yùn)化;佐以茯苓滲濕健脾，配白術(shù)健運(yùn)脾氣，使人參、白術(shù)補(bǔ)而不滯，濕無(wú)所聚，痰無(wú)所生;半夏燥濕化痰、和胃止嘔，配以陳皮理氣健脾，二藥合用，共奏理氣健脾、燥濕化痰、消痞散結(jié)之效;砂仁行氣調(diào)中，和胃醒脾;木香行氣止痛、醒脾和胃，能升降諸氣;甘草和中益氣，擅長(zhǎng)發(fā)揮調(diào)和諸藥藥性的作用。諸藥合用，共奏健脾和胃、理氣暢中之效。

VEGF可促進(jìn)血管生成，在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。有研究表明，VEGF在胃癌前病變（PLGC）階段即存在較高表達(dá)，在胃癌發(fā)生早期階段可能起一定作用[14]。藺煥萍[15]通過(guò)免疫組化檢測(cè)小鼠PLGC組織中VEGF、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT3）和HIF-1α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)中藥參佛胃康可下調(diào)HIF-1α、STAT3和VEGF的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)PLGC病變，其逆轉(zhuǎn)PLGC的機(jī)制與降低VEGF-STAT3-HIF-1α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)，抑制異型增生，促進(jìn)修復(fù)有關(guān)。有研究表明，黃芪多糖可下調(diào)PLGC模型大鼠p53、p65、VEGF蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡指數(shù)，從而控制PLGC進(jìn)展[16]。

PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、增生、遷移、分化和代謝。作為PI3K/AKT信號(hào)通路重要的負(fù)調(diào)控因子，PTEN通過(guò)使磷脂酰肌醇（3，4，5）-三磷酸（PIP3）脫磷酸生成PIP2以保持PIP3的低水平，從而抑制PI3K/AKT通路的活化以達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的[17-18]。Yang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，正常胃黏膜及腸化生組織中PTEN蛋白表達(dá)明顯高于不典型增生及胃癌，且呈遞減趨勢(shì)，表明在正常胃黏膜發(fā)展到胃癌過(guò)程中，PTEN蛋白表達(dá)下降，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖分化能力減弱，促進(jìn)腫瘤發(fā)展，說(shuō)明PTEN在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起抑制作用。

PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110所組成，且PI3K本身具有絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶的活性。一旦PI3K被激活，p110可以使PIP2磷酸化轉(zhuǎn)化為PIP3，進(jìn)而與AKT的N端PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促使AKT活化。而活化的AKT則能通過(guò)磷酸化作用于下游促凋亡蛋白BAD而發(fā)揮作用。韋維等[20]采用MNNG復(fù)制CAG大鼠模型，并運(yùn)用安胃湯進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜PI3K、AKT基因及蛋白表達(dá)升高，PTEN基因及蛋白表達(dá)下降;經(jīng)中藥治療后大鼠PI3K、AKT基因及蛋白表達(dá)下降，PTEN基因及蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路參與CAG大鼠胃黏膜病變，且通過(guò)下調(diào)胃黏膜細(xì)胞PI3K、AKT基因及蛋白的表達(dá)，上調(diào)胃黏膜細(xì)胞PTEN基因及蛋白的表達(dá)，達(dá)到治療CAG的作用。王彥剛等[21]采用隨機(jī)單盲對(duì)照臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將80例CAG患者隨機(jī)分為2組，治療組予化濁解毒方治療，對(duì)照組予阿拉坦五味丸治療，結(jié)果表明化濁解毒方能顯著降低血清及胃黏膜組織AKT、受體酪氨酸激酶（c-Met）的表達(dá)，說(shuō)明調(diào)控AKT、c-Met的表達(dá)水平能對(duì)慢性胃炎產(chǎn)生作用。江明禮等[22]構(gòu)建幽門(mén)螺桿菌（Hp）感染慢性胃炎動(dòng)物模型，給予苗藥頭花蓼治療后，采用Western?blot和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠胃黏膜組織，結(jié)果顯示苗藥頭花蓼可能通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)、抑制AKT表達(dá)，從而改善Hp引起的胃黏膜炎癥。

本研究結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠胃組織PTEN基因及蛋白表達(dá)顯著降低，提示CAG發(fā)病與大鼠胃組織PTEN基因及蛋白表達(dá)降低有關(guān);與模型組比較，香砂六君子湯高劑量組大鼠胃組織PTEN基因及蛋白表達(dá)顯著升高，提示香砂六君子湯通過(guò)上調(diào)CAG大鼠胃組織PTEN基因及蛋白表達(dá)而治療CAG。與空白組比較，模型組大鼠胃組織VEGF含量及AKT、PI3K基因及蛋白表達(dá)顯著升高，提示CAG發(fā)病與胃組織VEGF含量及AKT、PI3K基因及蛋白表達(dá)升高有關(guān);與模型組比較，香砂六君子湯高劑量組大鼠胃組織VEGF含量及AKT、PI3K基因及蛋白表達(dá)顯著降低，提示香砂六君子通過(guò)下調(diào)CAG大鼠胃組織VEGF含量及AKT、PI3K基因和蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)增殖和凋亡平衡機(jī)制，從而改善CAG病變。

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（收稿日期：2019-07-05）

（修回日期：2019-07-20;編輯：華強(qiáng)）