徐毅，閆美玲，馬繼飛，趙芳菲，孫艷紅，王麗華，高基民

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所微觀界面物理與探測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 物理生物學(xué)研究室，上海 201800）

光學(xué)成像探針的發(fā)展為疾病的早期診斷和治療提供了有效的手段，相比可見(jiàn)光成像探針，近紅外（near infrared，NIR）熒光探針具有更高的組織穿透深度和更低的組織散射[1]，在活體動(dòng)物成像中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。NIR熒光發(fā)射的波長(zhǎng)可分為NIR一區(qū)（NIR-I，750～900 nm）、NIR二區(qū)（NIR-II，900～1 400 nm），NIR二區(qū)波長(zhǎng)更長(zhǎng)，可顯著降低光在穿透生物組織中的散射現(xiàn)象，加上其光子自身組織吸收少，引起自發(fā)熒光效應(yīng)低等特點(diǎn)，在體內(nèi)成像中可以穿透深部組織，具有更高的空間分辨率[2]。ANTARIS等[3]用NIR二區(qū)熒光探針CH1055和一區(qū)的ICG對(duì)比發(fā)現(xiàn)，NIR二區(qū)熒光探針在活體成像中，可達(dá)到微米級(jí)的空間分辨率，約4 mm的組織穿透深度，較NIR一區(qū)的0.2 mm的穿透深度、毫米級(jí)的空間分辨有非常顯著的提升。YI等[4]用NIR二區(qū)的熒光探針CH1055-WL對(duì)小鼠體內(nèi)的關(guān)節(jié)缺損部位成像，可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)由關(guān)節(jié)炎病變成關(guān)節(jié)缺損的過(guò)程。硫化銀量子點(diǎn)（Ag2S QDs）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的NIR二區(qū)量子點(diǎn)，DU等[5]于2010年首次報(bào)道了Ag2S QDs的熒光性質(zhì)，它不僅具有較高的量子效率和熒光強(qiáng)度，而且具有非常好的生物相容性[6-7]。LI等[8]用NIR二區(qū)量子點(diǎn)Ag2S實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)裸鼠體內(nèi)腫瘤部位血管生及淋巴引流的過(guò)程?；贏g2S QDs作為成像探針的優(yōu)勢(shì)，我們前期已經(jīng)用腦靶向肽ANG修飾Ag2S QDs得到NIR二區(qū)的熒光探針[9]，該探針具有一定靶向?qū)嶓w瘤的能力，本研究我們進(jìn)一步比較分析其體外跨血腦屏障情況，為后續(xù)的腦部原位瘤成像奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：Angiopep-2多肽，其序列為TFFY GGSRGKRNNFKTEEY，相對(duì)分子質(zhì)量為2 301.5，等電點(diǎn)10.0，購(gòu)于上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；Ag2S、Ag2S-PEG量子點(diǎn)購(gòu)于蘇州納米所；普通碳支持膜購(gòu)于北京中鏡科儀技術(shù)有限公司；交聯(lián)劑EDC/NHS、瓊脂糖、多聚甲醛、十二烷基磺酸鈉（SDS）購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑嗅鹽（MTT）購(gòu)于西格瑪奧德里齊（上海）貿(mào)易有限公司公司；Transwell培養(yǎng)板購(gòu)于上海百賽生物科技有限公司；MEM、DMEM培養(yǎng)、Gibco胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Life Tech公司；青鏈霉素購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板購(gòu)于西格瑪奧德里齊（上海）貿(mào)易有限公司。

1.1.2 細(xì)胞株：bEnd.3細(xì)胞系（小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞）購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。U87 MG細(xì)胞系（人源膠質(zhì)瘤細(xì)胞）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 主要儀器：納米粒徑電位分析儀購(gòu)于英國(guó)Malvern公司，電泳裝置購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，場(chǎng)發(fā)射透射電鏡購(gòu)于美國(guó)FET公司，超純水儀購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，控溫振蕩器、低溫高速離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Nuair公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)于蘇州凈化設(shè)備有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Gene公司，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Nuair公司，X系列質(zhì)譜儀購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Ag2S、Ag2S-PEG QDs表面修飾ANG多肽：在交聯(lián)劑EDC/NHS介導(dǎo)下，Ag2S、Ag2S-PEG量子點(diǎn)的-COOH和腦靶向肽Angiopep-2（ANG）的-NH2發(fā)生縮合反應(yīng)進(jìn)行連接，加入少量NH3·H2O，使溶液由渾濁變澄清，之所以用EDC和NHS交聯(lián)劑，是因?yàn)樗鼈兊姆磻?yīng)要優(yōu)于醛類交聯(lián)劑，EDC只是幫助分子的羧基和氨基之間形成酰胺鍵，而本身并沒(méi)有成為實(shí)際交聯(lián)的一部分，EDC首先是和羧基形成一個(gè)O-異?；褰Y(jié)構(gòu)，這一活化中間物并不穩(wěn)定，而NHS通過(guò)形成更穩(wěn)定的酯而增強(qiáng)該活化中間物的穩(wěn)定性可以消除并被清洗掉[10]。整個(gè)過(guò)程分為3步：首先，稱量EDC 8.21 mg、NHS 15.60 mg、ANG 0.32 mg，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量將EDC和NHS配制成2 mmol/L溶液，將ANG配制成200 μmol/L的溶液；然后，取15 μL Ag2S-COOH（10 μmol/L）和Ag2S-PEG-COOH（10 μmol/L）量子點(diǎn)，加入等體積的ANG，再加入等體積的EDC/NHS，此時(shí)溶液變渾濁，再慢慢加入稀釋過(guò)的氨水，待溶液變澄清后，再將混合液在控溫振蕩器（300 r/min）震蕩30 min，再加入三倍體積的EDC/NHS在控溫振蕩器（300 r/min）震蕩8 h；最后，將溶液轉(zhuǎn)移至超濾管，在3 000×g條件下離心15 min，然后倒置超濾管在1 000×g條件下離心10 min，收集溶液。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳表征：取0.3 g的瓊脂糖粉末溶于30 mL的0.5×TBE中，在微波爐中加熱使瓊脂糖全部溶解，配成1%的瓊脂糖凝膠，然后倒入電泳槽中，膠凝固后進(jìn)行電泳。將Ag2S、Ag2S-ANG和Ag2SPEG、Ag2S-PEG-ANG稀釋到同一濃度（1 mg/mL），分別在不同的上樣孔中上樣10 μL，100 V電泳20 min，取出膠置于NIR二區(qū)成像儀中進(jìn)行成像，同時(shí)拍攝白光照片。

1.2.3 Zeta電位及動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）表征：將Ag2S、Ag2S-ANG、Ag2SPEG、Ag2S-PEG-ANG稀釋到同一濃度（20 μg/mL），然后將稀釋后的溶液放入比色皿中，分別置于納米粒度及電位分析儀中進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射和ξ電位分析，每個(gè)樣品設(shè)3管重復(fù)樣，進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）表征：TEM表征要事先制樣，將Ag2S、Ag2S-ANG、Ag2S-PEG、Ag2S-PEG-ANG稀釋到相同的濃度，每個(gè)樣品取10 μL，滴在2個(gè)銅網(wǎng)上，讓其自然風(fēng)干，然后置于TEM下進(jìn)行粒徑分析。

1.2.5 細(xì)胞毒性分析：采用MTT方法，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：①將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87 MG細(xì)胞用胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，以每孔100 μL（1×104個(gè)細(xì)胞）的體積將單個(gè)細(xì)胞懸液接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。②培養(yǎng)24 h后，棄去96孔板中舊的培養(yǎng)基，加入不同濃度的ANG多肽修飾的Ag2S、Ag2S-PEG量子點(diǎn)（終濃度分別為100、10、1、0.1 μg/mL），與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。③共培養(yǎng)至20 h，向96孔板中加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），其終濃度是0.5 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。④共培養(yǎng)至24 h，每孔加入110 μL酸化的SDS（pH 3.0～4.0），孵育過(guò)夜，充分溶解。⑤過(guò)夜后，吸出96孔板中的溶液至1.5 mL離心管中，14 000 r/min離心15 min，離心后，取200 μL上清于新的96孔板中，酶標(biāo)儀570 nm檢測(cè)各孔吸收值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.6 體外血腦屏障建立：采用小鼠的bEnd.3細(xì)胞建立體外血腦屏障模型，bEnd.3細(xì)胞是小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。在該模型使用的細(xì)胞培養(yǎng)板是專用的transwell培養(yǎng)板（見(jiàn)圖1），這種培養(yǎng)板主體是24孔板，在其中的12孔上懸掛有小室（transwell），小室底部是一層聚碳酸酯膜（孔徑0.3 μm），小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室，上室內(nèi)用于培養(yǎng)bEnd.3細(xì)胞，下室用于培養(yǎng)U87 MG細(xì)胞，等上層的bEnd.3細(xì)胞的電阻達(dá)到300 Ω時(shí)即可作為體外血腦屏障使用。

方法如下：①將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的bEnd.3細(xì)胞用胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，然后將bEnd.3細(xì)胞鋪到上室，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，體積為200 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②培養(yǎng)過(guò)程中要不斷地測(cè)量上室細(xì)胞的電阻，并且經(jīng)常換液，以免細(xì)胞因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)不夠而死亡，當(dāng)電阻到達(dá)300 Ω時(shí)，說(shuō)明bEnd.3細(xì)胞已經(jīng)形成致密連接，可以開(kāi)始試驗(yàn)。③在上室細(xì)胞電阻快要符合要求時(shí)，提前在下室鋪滿U87 MG細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)1×104個(gè)，體系為500 μL，鋪5組共15個(gè)孔，Ag2S、Ag2S-ANG、Ag2S-PEG、Ag2S-PEG-ANG四種量子點(diǎn)各3個(gè)孔，空白對(duì)照3個(gè)孔。④電阻達(dá)到300 Ω時(shí)，將上室轉(zhuǎn)移到鋪有U87 MG細(xì)胞的24孔板中，并換液，加入終濃度為20 μg/mL的Ag2S、Ag2S-ANG、Ag2S-PEG、Ag2S-PEG-ANG四種量子點(diǎn)，體系為200 μL不變，孵育過(guò)夜。⑤孵育完畢，用胰酶消化上室和下室的bEnd.3細(xì)胞和U87 MG細(xì)胞，然后收集上室和下室的細(xì)胞，并且收集下室的培養(yǎng)基，然后通過(guò)ICP-MS分別測(cè)量上室bEnd.3細(xì)胞Ag含量、下室U87 MG細(xì)胞Ag的含量以及下室培養(yǎng)基中Ag的含量。

圖1 Transwell培養(yǎng)板示意圖

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ag2S、Ag2S-PEG QDs修飾前后表征結(jié)果

2.1.1 瓊脂糖電泳表征結(jié)果：Ag2S、Ag2S-PEG QDs經(jīng)過(guò)ANG多肽修飾后，溶液的顏色和熒光性質(zhì)沒(méi)有明顯的變化，從瓊脂糖凝膠電泳可以看出，修飾ANG多肽的Ag2S、Ag2S-PEG量子點(diǎn)的條帶位置要比未修飾ANG多肽的Ag2S、Ag2S-PEG量子點(diǎn)遷移距離短（見(jiàn)圖2），瓊脂糖電泳是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行分離的，也就是說(shuō)Ag2S-ANG、Ag2S-PEG-ANG量子點(diǎn)的相對(duì)分子質(zhì)量增加。

圖2 Ag2S、Ag2S-PEG經(jīng)ANG多肽修飾前后的量子點(diǎn)白光圖、熒光圖及瓊脂糖凝膠電泳圖

2.1.2 Zeta電位和DLS表征結(jié)果：Zeta電位檢測(cè)結(jié)果表明，Ag2S、Ag2S-PEG量子點(diǎn)表面呈負(fù)電性，而修飾了ANG多肽的Ag2S、Ag2S-PEG量子點(diǎn)帶正電（見(jiàn)表1），這是因?yàn)锳NG多肽的等電點(diǎn)是10，所以在該溶液中帶正電，導(dǎo)致修飾了ANG多肽的Ag2S、Ag2SPEG量子點(diǎn)帶正電。DLS的結(jié)果表明修飾了ANG多肽的Ag2S量子點(diǎn)的水合粒徑增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

表1 Ag2S、Ag2S-PEG量子點(diǎn)經(jīng)ANG修飾前后Zeta電位變化（每組n=3

表1 Ag2S、Ag2S-PEG量子點(diǎn)經(jīng)ANG修飾前后Zeta電位變化（每組n=3

量子點(diǎn) Zeta電位（mV）Ag2S -11.5±1.6 Ag2S-ANG +28.7±1.4 Ag2S-PEG -5.3±1.6 Ag2S-PEG-ANG +2.8±1.0

圖3 Ag2S、Ag2S-PEG量子點(diǎn)經(jīng)ANG修飾前后水合粒徑變化

圖4 Ag2S、Ag2S-PEG量子點(diǎn)經(jīng)ANG修飾前后的TEM表征

2.1.3 TEM表征結(jié)果：利用TEM對(duì)Ag2S和Ag2S-PEG量子點(diǎn)修飾前后的粒徑進(jìn)行表征（見(jiàn)圖4A），隨機(jī)選取50個(gè)量子點(diǎn)，用Gatan Digital Micrograph軟件分別統(tǒng)計(jì)Ag2S和Ag2S-PEG量子點(diǎn)修飾前后的大小。TEM結(jié)果表明，Ag2S量子點(diǎn)的粒徑約5 nm，Ag2S-ANG量子點(diǎn)的粒徑約為7 nm，Ag2S-PEG的粒徑約8 nm，Ag2S-PEG-ANG的粒徑約8.5 nm，經(jīng)過(guò)修飾后粒徑增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4B。結(jié)合電泳和DLS及Zeta電位結(jié)果，表明ANG短肽成功修飾在Ag2S量子點(diǎn)上。

2.2 細(xì)胞毒性 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，Ag2S和Ag2SANG量子點(diǎn)與U87 MG細(xì)胞共孵育24 h后，在100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率接近100%，修飾前后對(duì)bEnd.3細(xì)胞未顯示明顯的毒性，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），對(duì)U87 MG細(xì)胞也未顯示明顯的毒性，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 Ag2S、Ag2S-PEG量子點(diǎn)經(jīng)ANG修飾前后對(duì)U87 MG細(xì)胞和bEnd.3細(xì)胞的細(xì)胞毒性

2.3 Ag2S、Ag2S-PEG QDs修飾前后穿過(guò)體外血腦屏障情況 在所建立的體外模型中，多肽修飾的Ag2SANG、Ag2S-PEG-ANG和帶PEG的Ag2S-PEG三種量子點(diǎn)均能穿過(guò)bEnd.3細(xì)胞層，到達(dá)下室的培養(yǎng)基中，而Ag2S量子點(diǎn)基本不能穿過(guò)bEnd.3細(xì)胞層，在下層培養(yǎng)基中只檢測(cè)到極少量的Ag2S量子點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖6A。Ag2S-ANG量子點(diǎn)被下層U87 MG細(xì)胞攝取的含量約是Ag2S的6倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），U87 MG細(xì)胞對(duì)Ag2S-PEG-ANG量子點(diǎn)的攝取量比Ag2S-PEG也有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但攝取量遠(yuǎn)不及Ag2S-ANG多，見(jiàn)圖6B。結(jié)果表明，Ag2S-ANG、Ag2S-PEG和Ag2S-PEG-ANG量子點(diǎn)都可以穿過(guò)體外血腦屏障系統(tǒng)，但是穿過(guò)后Ag2S-ANG對(duì)U87 MG細(xì)胞的靶向能力較其他兩種量子點(diǎn)更強(qiáng)。

圖6 4種量子點(diǎn)在體外血腦屏障穿透情況及攝取情況

3 討論

近年來(lái)，雖然疾病的診斷和治療技術(shù)發(fā)展迅速，但是傳統(tǒng)的腦部疾病的診斷和治療還存在一些局限。在診斷方面，成像技術(shù)的缺陷（如分辨率低、穿透深度低、循環(huán)時(shí)間短等）使得診斷不準(zhǔn)確或難以診斷[11-12]。在治療方面，由于血腦屏障復(fù)雜的結(jié)構(gòu)[13-14]以及豐富的酶系統(tǒng)，治療藥物很難到達(dá)腦部發(fā)揮治療作用[15-18]。

納米顆粒具有量子尺寸效應(yīng)，較大的比表面積和較高的吸附活性，這使得它可以在生物體內(nèi)自由移動(dòng)，特定的光吸收，低濃度沒(méi)有毒性，若修飾一些腦靶向性的分子使其具有一定的腦部靶向性，可廣泛應(yīng)用于腦成像探針[19-24]。納米材料可以在腦靶向分子[25-27]的協(xié)助下穿過(guò)血腦屏障，到達(dá)腦部，這為腦部病變的診斷和藥物的腦靶向輸送帶來(lái)了新的契機(jī)。如LIU等[27]利用超聲波和磁場(chǎng)的協(xié)同作用，將有治療效果的磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）帶入腦部，成功跨越血腦屏障，并且利用MRI對(duì)MNPs進(jìn)行監(jiān)控。QIAN等[28]將納米金包裹上PEG，并進(jìn)行表面拉曼光譜增強(qiáng)，形成金納米顆粒復(fù)合物，這種復(fù)合物在NIR區(qū)域的光學(xué)信號(hào)比有機(jī)染料強(qiáng)，當(dāng)連接上靶向腫瘤的配體時(shí)，這復(fù)合物能夠靶向腫瘤并進(jìn)行成像。GAO等[29]用半導(dǎo)體量子點(diǎn)成功實(shí)現(xiàn)體內(nèi)靶向腫瘤的成像，他們?cè)诹孔狱c(diǎn)上修飾具有靶向腫瘤的生物分子，使得探針具有高的滲透性和長(zhǎng)的腫瘤位點(diǎn)代謝，并且得到了清晰的體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的圖像。在之前的研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了基于Ag2S量子點(diǎn)的NIR二區(qū)熒光成像探針Ag2S-ANG，對(duì)腦膠質(zhì)瘤荷瘤鼠的實(shí)體瘤具有一定的靶向性[9]，在此基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了2種腦靶向的Ag2S-ANG和Ag2S-PEG-ANG熒光成像探針，利用體外血腦屏障模型進(jìn)一步比較研究了修飾前后穿透體外血腦屏障情況，發(fā)現(xiàn)Ag2S-ANG、Ag2S-PEG和Ag2S-PEGANG均可穿過(guò)體外血腦屏障，并且Ag2S-ANG能被腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞大量攝取，這為進(jìn)一步的腦原位腫瘤的NIR二區(qū)成像奠定了基礎(chǔ)。