馬玉花，張澤高，馬苗苗，熱伊拉·麥買提伊敏，開麗曼·阿不都巴熱，楊杰，祁小麗

宮頸癌是世界女性第二大惡性腫瘤，也是第二大最常見惡性腫瘤死亡原因［1］。發(fā)展中國家宮頸癌晚期病例更常見，包括ⅠB2～ⅣA期［2］。順鉑對晚期宮頸癌化療有效，但容易產(chǎn)生耐藥，且耐藥的機(jī)制尚未定論［3］。極光激酶A（Aurora A）在細(xì)胞周期進(jìn)展的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，是體內(nèi)腫瘤形成的必需條件［4］。有報(bào)道Aurora A抑制劑MLN8237在順鉑（DDP）耐藥的胃癌細(xì)胞系中可逆轉(zhuǎn)其耐藥性［5］，但在宮頸癌中尚缺乏相關(guān)研究。本研究自2017年11月至2018年11月探討極光激酶A抑制劑與順鉑在體外宮頸癌細(xì)胞系聯(lián)合應(yīng)用的效果，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與藥品 兔抗人P（T288）-Aurora A多克隆抗體購自美國Abcam 公司，兔抗人P53（9282）抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司，兔抗人P（S315）-P53（2528）抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司，兔抗人P21WAP1/cip1（2947）抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司。堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG羊抗兔二抗購自北京鐘彬中橋生物公司，順鉑購自中國齊魯制藥有限公司，MLN8237 購自美國Selleck 公司，細(xì)胞凋亡（556547）檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞系 宮頸鱗狀細(xì)胞癌HCC94 細(xì)胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞貼壁生長在25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素及10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)5%及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次。

1.3.2 四唑鹽（MTT）法檢測 MLN8237 對細(xì)胞增殖能力的影響取對數(shù)生長期HCC94細(xì)胞，細(xì)胞密度為5×104/mL，于前一天下午接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100μL，置于37 ℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。至細(xì)胞單層鋪滿孔底，加入濃度梯度的藥物，次日上午加藥，每孔100μL。設(shè)6～7 個(gè)梯度，5 個(gè)復(fù)孔。以終濃度MLN8237 為5、10、20、40、80 和160μmol/L，DDP 2.5、5、10、20、40、80 和160μmol/L 加入藥物。對照孔加入相同濃度的藥物溶解介質(zhì)二甲基亞砜（DMSO）。另設(shè)只加培養(yǎng)液的調(diào)零孔。聯(lián)合作用組以小劑量進(jìn)行聯(lián)合作用，同時(shí)加入聯(lián)合作用藥物。藥物濃度分別以MLN8237 為5、10、20 μmol/L，DDP 2.5、5、10、20μmol/L。分別在給藥24 h 和48 h 后每孔加入5 g/L MTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，吸棄培養(yǎng)液加入DMSO 150μL，振蕩15 min，酶標(biāo)儀570 nm波長，比色測定OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算腫瘤細(xì)胞存活率（%）：＝（實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零孔OD值/對照組OD值-調(diào)零組OD值）×100%。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 MLN8237 聯(lián)合順鉑對HCC94 細(xì)胞凋亡的影響MLN8237（終濃度2 μmol/L）、順鉑（終濃度1μmol/L），分別單獨(dú)作用和聯(lián)合作用48 h，收獲細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，分別按細(xì)胞凋亡試劑盒說明書操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果分析采用ModFit軟件。

1.3.4 Western 印跡方法 用MLN8237（終濃度2 μmol/L），順鉑（終濃度1 μmol/L）和MLN8237（2μmol/L）加順鉑（終濃度1μmol/L）培養(yǎng)HCC94細(xì)胞（5×106/mL）48 h 收獲細(xì)胞。按說明書提取蛋白，進(jìn)行定量，取25μg蛋白上樣。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，12%分離膠，轉(zhuǎn)印到PVDF 膜，將膜移至含有QuickBlockTMWestern 封閉液的平皿中，室溫封閉20 min。適當(dāng)濃度一抗孵育4 ℃過夜，辣根過氧化酶羊抗兔二抗孵育1～2 h，Western 洗滌液洗滌，ECL 顯色液顯色，放入BIO-RAD 凝膠成像分析系統(tǒng)，得到印跡圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，收集數(shù)據(jù)，取平均值。采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。藥物相互作用分析采用兩因素多水平析因設(shè)計(jì)，統(tǒng)計(jì)分析采用析因設(shè)計(jì)方差分析；計(jì)量資料以xˉ±s 表示，采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MLN8237處理后細(xì)胞形態(tài)變化 采用倒置顯微鏡觀察，傳代細(xì)胞接種過夜后，貼壁良好，1～2 d后進(jìn)入對數(shù)生長期，3～4 d后貼滿瓶壁，各組細(xì)胞培養(yǎng)基均清亮。對照組細(xì)胞生長密集，貼壁良好，表面清晰，大小一致，折光度均一，細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞界限清晰，核仁多，胞質(zhì)豐富。各加藥組細(xì)胞增殖明顯變慢，集落形成減少，密度均較對照組為低，MLN8237作用組細(xì)胞體積逐漸增大，出現(xiàn)較多空泡，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，折光率降低，部分細(xì)胞變圓脫落，漂浮細(xì)胞增多，細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，細(xì)胞形態(tài)改變，隨藥物濃度增高，作用時(shí)間延長更加明顯（圖1）。

圖1 宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞（HCC94）：A、B為對照組低倍鏡（×100）和高倍鏡（×400）下；C、D為MLN8237處理24 h后低倍鏡（×100）和高倍鏡（×400）下；E、F為MLN8237處理48 h后低倍鏡（×100）和高倍鏡（×400）下

2.2 順鉑、MLN8237及兩者聯(lián)合對HCC94細(xì)胞生長的影響 MTT 法檢測結(jié)果顯示，順鉑、MLN8237≥10 μmol/L 時(shí)均明顯抑制HCC94 細(xì)胞的生長，且隨藥物濃度加大和作用時(shí)間延長，抑制作用都得到加強(qiáng)（圖2）。

圖2 順鉑（A）和MLN8237（B）對HCC94細(xì)胞生長的抑制

2.3 MLN8237和順鉑不同濃度聯(lián)合應(yīng)用對HCC94細(xì)胞增殖的影響 選擇具有抑制作用，但單獨(dú)作用不明顯的MLN8237 濃度5、10 和20 μmol/L，順鉑2.5、5、10 和20μmol/L，時(shí)間點(diǎn)24 h 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。多因素方差分析顯示，順鉑不同劑量抑制HCC94細(xì)胞增殖效果不同（F＝393.11，P＜0.01），MLN8237不同劑量抑制HCC94 細(xì)胞增殖效果不同（F＝335.85，P＜0.01），順鉑和MLN8237有交互作用（F＝7.99，P＜0.01）。順鉑20μmol/L 和MLN8237 20μmol/L 聯(lián)合作用，對HCC94 細(xì)胞增殖抑制效果最好。兩兩比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表1，圖3。

表1 MLN8237和順鉑不同濃度聯(lián)合應(yīng)用對HCC94細(xì)胞增殖的影響/（%，）

表1 MLN8237和順鉑不同濃度聯(lián)合應(yīng)用對HCC94細(xì)胞增殖的影響/（%，）

順鉑MLN8237 0μmol/L 2.5μmol/L 5μmol/L 10μmol/L 20μmol/L 0μmol/L 100.00±0.00 95.54±1.35 91.93±1.84 85.73±2.55 52.16±4.68 5μmol/L 94.74±2.21 85.26±3.51 67.43±4.23 54.62±3.26 41.97±5.21 10μmol/L 86.59±1.25 78.65±2.36 59.65±4.53 42.32±3.96 29.65±5.18 20μmol/L 65.48±2.53 56.84±2.54 48.46±3.87 36.62±4.53 19.26±5.26

圖3 順鉑和MLN8237聯(lián)合作用對HCC94細(xì)胞生長的抑制作用

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測順鉑、MLN8237 處理后細(xì)胞凋亡的變化 MLN8237 處理組凋亡率較對照組顯著增高，早期凋亡為主，少量晚期凋亡；順鉑組早期凋亡率較對照組有增高，主要為早期凋亡；聯(lián)合組早期、晚期凋亡率均較各單藥組加強(qiáng)，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2，圖4。

表2 不同藥物處理48 h后HCC94細(xì)胞凋亡情況/

表2 不同藥物處理48 h后HCC94細(xì)胞凋亡情況/

注：與對照組比較，aP＜0.05；與各單藥組比較，bP＜0.05，DDP為順鉑

晚期凋亡0.08±0.07 4.45±1.27a 0.41±0.34a 11.94±3.76ab組別對照組MLN8237 DDP MLN8237+DDP早期凋亡0.04±0.02 20.42±4.68a 12.61±3.42a 36.52±4.82ab

2.5 蛋白印跡結(jié)果 MLN8237 處理組P21wap1/Cip1和P53表達(dá)較對照組顯著增高，P（S315）-P53和P（T288）-Aurora A 表達(dá)顯著降低，Aurora A 表達(dá)不改變。順鉑組P21wap1/Cip1和P53表達(dá)較對照組輕微增高，P（S315）-P53 表達(dá)輕微降低，Aurora A 和P（T288）-Aurora A 蛋白表達(dá)不改變。聯(lián)合組對以上各種蛋白的影響作用較各單藥組加強(qiáng)（圖5）。

圖5 不同藥物處理HCC94細(xì)胞48 h后蛋白表達(dá)變化情況

3 討論

雖然為了提高宮頸癌患者的預(yù)后，目前有很多治療方法在不斷探索中［6-7］。但最新NCCN 指南仍推薦，以DPP為基礎(chǔ)的同期放化療為目前中晚期宮頸癌的一線治療方案。DPP也被認(rèn)為是晚期和復(fù)發(fā)宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)化療方案［8］。但順鉑化療可引起消化道反應(yīng)，很多患者不能耐受；且順鉑化療抗拒也影響了治療效果，使順鉑使用受到極大限制。因此，在提高早期檢出率的同時(shí)，有必要篩選有效的治療靶點(diǎn)，并在不增加順鉑化療藥物劑量或不良反應(yīng)的前提下提高療效。

圖4 不同藥物處理48 h后HCC94細(xì)胞的凋亡情況

人體細(xì)胞通過有絲分裂進(jìn)行增殖分化，有絲分裂進(jìn)展準(zhǔn)確，對于維持染色體穩(wěn)定性至關(guān)重要［9］。通過及時(shí)準(zhǔn)確調(diào)節(jié)多種激酶活性，才可確保有絲分裂順利進(jìn)展。絲氨酸/蘇氨酸激酶Aurora A 表達(dá)或功能異常，都會(huì)導(dǎo)致遺傳物質(zhì)分配紊亂，出現(xiàn)非整倍體［10］。不穩(wěn)定非整倍體形成，是腫瘤的成因。有研究發(fā)現(xiàn)，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中Aurora A 高表達(dá)患者預(yù)后差，減少其表達(dá)，可抑制細(xì)胞增殖和增加凋亡［11］；增加其表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤增殖［10］。Aurora-A 抑制劑MLN8237 是抗腫瘤治療的有效策略［12］，Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗(yàn)顯示，其效果及安全性良好，目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。我們前期研究已證實(shí)極光激酶可預(yù)測宮頸癌放療抵抗和預(yù)后不良，其小分子抑制劑可逆轉(zhuǎn)放療抵抗［13］，以順鉑為基礎(chǔ)的同期放化療又是目前中晚期宮頸癌的一線治療方案，如果極光激酶A 抑制劑對順鉑有顯著化療增敏作用，那么將為臨床推廣應(yīng)用提供更有利的依據(jù)。

本研究采用MLN8237 聯(lián)合順鉑處理HCC94 細(xì)胞，結(jié)果表明，兩藥低濃度聯(lián)合應(yīng)用，會(huì)明顯抑制細(xì)胞增殖，顯著提高凋亡率。蛋白印跡顯示經(jīng)MLN8237處理后，P53的Ser315位點(diǎn)磷酸化表達(dá)降低，P53表達(dá)增高。P53的Ser315位點(diǎn)磷酸化，可促進(jìn)MDM2介導(dǎo)的P53降解。本研究提示Aurora A抑制劑MLN8237減少P53 的Ser315 位點(diǎn)磷酸化，抑制MDM2 介導(dǎo)的P53降解。DNA損傷后，P53蛋白水平明顯升高，啟動(dòng)下游細(xì)胞修復(fù)機(jī)制，如P21 Waf1/Cip1蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞周期停滯于G1期，對損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)。如修復(fù)成功，則細(xì)胞周期進(jìn)入S期，失敗則損傷細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞程序性死亡，即凋亡階段。本研究中，P21 wap1蛋白經(jīng)MLN8237處理，表達(dá)明顯增高，DPP處理組未見明顯變化，聯(lián)合組表達(dá)顯著增高，與相關(guān)研究結(jié)果一致。本研究還顯示，MLN8237不改變Aurora A表達(dá)，但降低P（T288）-Aurora A表達(dá)。

有研究和我們結(jié)果一致，Aurora A 是非小細(xì)胞肺癌患者中不良預(yù)后和順鉑治療抵抗的生物標(biāo)志物，并通過構(gòu)建過表達(dá)和敲低表達(dá)體系，為其成為治療靶點(diǎn)和逆轉(zhuǎn)順鉑藥物耐藥提供了潛在證據(jù)［14］。Aurora A抑制劑VX680與順鉑對HepG2細(xì)胞以劑量和時(shí)間依賴性方式協(xié)同抑制增殖［15］。

綜上所述，MLN8237 作為Aurora A 的小分子選擇性抑制劑，不僅逆轉(zhuǎn)宮頸癌放療抵抗，而且也是一線同步化療方案以及晚期和復(fù)發(fā)宮頸癌標(biāo)準(zhǔn)化療方案——順鉑的良好增敏劑。本研究提供了抗宮頸癌治療的新方法新思路，為其進(jìn)一步臨床推廣提供了依據(jù)。