楊娜，王敏，王月園，柳航，朱懷軍，葛衛(wèi)紅

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210008)

雌激素作為人體內(nèi)重要的性激素之一，具有重要而廣泛的生理作用。研究表明，雌激素不僅有維持女性生殖功能和第二性征的生理作用，而且對代謝系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、骨骼的生長等有一定程度的影響[1-2]。雌二醇(Estradiol，E2)是體內(nèi)活性最強(qiáng)的雌激素，其通過細(xì)胞色素P450酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等重要酶類進(jìn)一步發(fā)生代謝[3]。目前。越來越多的研究證實(shí)，除雌二醇外，多種雌激素代謝產(chǎn)物同樣具有生物學(xué)活性，且與相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如2-羥基雌酮(2-Hydroxyestrone，2-OHE1)和16α-羥基雌酮(16α-Hydroxyestrone，16α-OHE1)比例降低可能增高乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險[4]， 4-甲氧基雌酮(4-Methoxyestrone，4MeOE1)可參與脂質(zhì)的調(diào)節(jié)等[5]。因此，對血清中雌激素代謝網(wǎng)絡(luò)各類代謝物的濃度分析和整體代謝輪廓描繪，對輔助臨床診斷、發(fā)現(xiàn)疾病生物標(biāo)志物以及疾病發(fā)病風(fēng)險的評估具有重要意義。臨床上內(nèi)源性類固醇激素的測定技術(shù)，包括液相紫外檢測法、氣相色譜法以及免疫測定法等[6-8]。其中，免疫測定法最常用于類固醇的檢測，但由于易受相關(guān)內(nèi)源性類固醇、脂質(zhì)和基質(zhì)效應(yīng)的干擾，其對于類固醇激素測定的特異性和可靠性仍然存在疑問。雖然部分研究采用HPLC-MS/MS法測定體內(nèi)激素含量，但往往存在測定種類少、分析時間長、靈敏度低等問題。本研究旨在建立快速、高靈敏度的血清雌激素UPLC-MS/MS分析方法，并對此方法進(jìn)行方法學(xué)考證，為雌激素的臨床檢測及雌激素相關(guān)疾病的研究提供支持。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑 雌二醇(Estradiol，E2，純度：96.3%，批號：100182-201205，中國食品藥品檢定研究院)；雌酮(Estrone，E1，批號：100849-200501，中國食品藥品檢定研究院)；雌三醇(Estriol， E3，純度：97.6%，批號：100934-201302，中國食品藥品檢定研究院)；2-羥基雌酮(2-Hydroxyestrone，2-OHE1，純度：98%，批號：3-SBT-43-2，加拿大TRC)；2-甲氧基雌酮(2-Methoxyestrone，2MeOE1，純度：98%，批號：2-AKS-176-1，加拿大TRC)；4-甲氧基雌酮(4-Methoxyestrone，4MeOE1，純度：97.72%，批號：1-SRE-175-1，加拿大TRC)；16-表雌三醇(16-Epiestriol，16epiE3，純度：96%，批號：29-AZC-158-2，加拿大TRC)；17-環(huán)雌三醇(17-Epiestriol，17epiE3，純度：95%，批號：20-THT-39-2，加拿大TRC)；2-羥基雌二醇(2-Hydroxyestradiol，2-OHE2，純度：96%，批號：6-SBT-57-6，加拿大TRC)；16α-羥基雌酮(16α-Hydroxyestrone， 16α-OHE1，純度：97%，批號：3-CGF-67-6，加拿大TRC)；2，3，4-13C3-雌酮(2，3，4-13C3-Estrone，E1-13C，IS，純度：98%，批號：MBBC4138，美國CIL)；丹磺酰氯(批號：BCBL7618V，Sigma)；叔丁基甲醚(阿拉丁)；Waters Oasis HLB固相萃取小柱(美國Waters)；葡聚糖-活性炭(批號：SLBV2046， Sigma)；色譜柱C18(Waters ACQUITY UPLC BEH C18)；L-抗壞血酸(批號SLBM0850V， Sigma)；甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck)。

1.1.2主要儀器 Waters ACQUITY UPLC I-Class /XEVO TQD超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters，美國)，CV200真空濃縮儀(北京吉艾姆科技有限公司)，TGL-16.5M冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，DW-HL340超低溫冰箱(Thermo Fisher，美國)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18columns(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；流動相：乙腈-水(含0.1%甲酸)，采用70%(乙腈)等度洗脫，流速0.3 mL·min-1；整個運(yùn)行時間：5 min；進(jìn)樣體積5 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件 離子源：點(diǎn)噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子模式；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細(xì)管電壓為3.2 kV；脫溶劑氣為氮?dú)猓撊軇囟葹?50 ℃，流速為800 L·h-1；碰撞氣為氬氣。各種雌激素的相關(guān)離子如表1所示。

表1 MRM模式離子參數(shù)

1.2.3儲備液和工作液配制 分別精密稱取雌激素標(biāo)準(zhǔn)品和同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)E1-13C(IS)粉末2 mg，置于20 mL量瓶中，加入含0.1%L-抗壞血酸的甲醇溶液定容至刻度線，顛倒搖勻配成終濃度為100 μg·mL-1的儲備液，-20 ℃儲存。分別取各類雌激素儲備液，依次用L-抗壞血酸甲醇梯度稀釋，分別配成濃度為0.2，0.5，1，2，5，10，20 ng·mL-1的雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。取內(nèi)標(biāo)儲備液，采用含0.1%L-抗壞血酸的甲醇溶液逐級稀釋至10 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。衍生化試劑配制：精密稱取丹磺酰氯試劑10 mg于15 mLEP管中，加入丙酮溶解，配置成1 g·L-1的丹磺酰氯衍生化試劑溶液，置于-20 ℃儲存。

1.2.4空白血清的制備 取空白血清10 mL，加入0.1 g 葡聚糖-活性炭后，旋渦混勻，于37 ℃搖床5 h后4000 r·min-1離心15 min，上清液于12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下低溫超速離心30 min，取上層澄清液，即為空白血。

1.2.5血清樣品的處理方法 取300 μL血清樣本，加入20 μL內(nèi)標(biāo)(10 ng·mL-1)混勻后，加入甲基叔丁基醚溶液1.5 mL渦旋振蕩3 min，于14 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清液1.3 mL于真空濃縮裝置中揮干。依次加入50 μL 0.1 mol·L-1的碳酸氫鈉緩沖液pH值9.0和50 μL丹磺酰氯衍生化試劑后振蕩，于60 ℃水浴加熱10 min衍生化。取出冰浴，并加入50 μL含0.1%甲酸乙腈-水溶液(1：1)，渦旋混勻后，于14 000 r·min-1，4 ℃離心5 min，取上清液5 μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

2.1分析方法優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件優(yōu)化 采用濃度為500 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行衍生化后，對11種雌激素及內(nèi)標(biāo)的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量進(jìn)行逐一優(yōu)化和確認(rèn)，使目標(biāo)化合物具有最高靈敏度，見表1。各類雌激素在衍生化處理后，極大提高了離子化效率，且進(jìn)入質(zhì)譜均能產(chǎn)生相應(yīng)強(qiáng)度高且穩(wěn)定性好的[M+H]+分子離子峰，衍生化試劑與母核結(jié)合進(jìn)入二級質(zhì)譜碎裂為171子離子碎片。

2.1.2液相條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，分別使用甲醇和乙腈作為有機(jī)相對梯度和等度不同流動相體系進(jìn)行比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時在乙腈和水中加入0.1%甲酸，并在70%乙腈等度洗脫時，能夠很好的分離各類激素，且各物質(zhì)峰形良好具有較高靈敏度。本方法在UPLC液相系統(tǒng)下，分析時間可以縮短到5 min，能夠快速高效的分析各雌激素，達(dá)到很好的定量分析效果。

2.1.3樣品處理優(yōu)化 采用葡聚糖-活性炭法能夠高效去除人血清中內(nèi)源性雌激素的干擾，比BSA代替血清更加合理[9]。本實(shí)驗(yàn)前期分別使用蛋白沉淀法、固相萃取法(Waters HLB 固相萃取柱)、二氯甲烷和叔丁基甲醚對血清樣本前處理進(jìn)行摸索。蛋白沉淀法雜質(zhì)干擾多，基質(zhì)效應(yīng)較高。液-液萃取法的重現(xiàn)性和精密度均優(yōu)于固相萃取，其中叔丁基甲醚萃取法具有較好的提取回收率，使各類雌激素的提取回收率均大于70%，并能保證較低的基質(zhì)干擾。此外，本實(shí)驗(yàn)通過對衍生化的溫度、時間、試劑濃度等進(jìn)行優(yōu)化得到最優(yōu)的衍生化條件。

2.2方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1特異性 按“1.2.5”項(xiàng)處理空白血清樣本和加入各類雌激素標(biāo)準(zhǔn)品血清樣本，如圖1所示，E1、E2、E3、16epiE3、17epiE3、2MeOE1、4MeOE1、16α-OHE1、2-OHE1、4-OHE1、2-OHE2和IS的保留時間分別為2.78，2.36，1.07，1.42，1.52，2.55，2.77，1.40，2.16，2.35，2.36 min和2.78 min。待測物和內(nèi)標(biāo)峰形良好，空白血清在各雌激素離子通道下無干擾，各類雌激素在該方法下特異性良好。

圖1 UPLC-MS/MS測定11種雌激素及內(nèi)標(biāo)的典型色譜圖

Fig.1Typicalchromatogramsof11estrogensandISinUPLC-MS/MSdetermination

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取空白血清270 μL，分別加入含雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液30 μL，使血清中濃度分別為20，50，100，200，500，1000，2000 pg·mL-1，按照“1.2.5”項(xiàng)下處理樣本以檢測目標(biāo)峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，血清濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸(權(quán)重1/X)。得到各類雌激素的標(biāo)準(zhǔn)方程如表2，各種雌激素在20～2000 pg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性，定量下限(LLOQ)均為20 pg·mL-1(S/N>10)。

2.2.3精密度和準(zhǔn)確度 取空白血清于3 d分別配制3批含LLOQ、低、中、高濃度(20，50，200，1 600 pg·mL-1)的混合雌激素的血清樣品，每個濃度平行6份，按照“1.2.5 ”項(xiàng)下處理樣本，測定后計算精密度與準(zhǔn)確度。由結(jié)果可知，精密度與準(zhǔn)確度均符合生物樣本測定需求。見表3。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.2.4提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 分別按照以下方法配制處理雌激素樣本，并計算提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)，計算結(jié)果見表4。

A：取空白血清，按“2.2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線處理方法，配制含有終濃度為50，200，1 600 pg·mL-1的混合雌激素血清樣本各6份，加入20 μL內(nèi)標(biāo)(10 ng·mL-1)混勻后按照“1.2.5”項(xiàng)處理血清樣品。取上清液5 μL進(jìn)樣分析，記錄各類雌激素的峰面積A1和內(nèi)標(biāo)峰面積AIS1。

B：取空白血清，加入1.5 mL甲基叔丁基醚溶液渦旋振蕩3 min，于14 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清液1.3 mL，分別加入雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液30 μL(濃度為0.5，2，16 ng·mL-1)、內(nèi)標(biāo)工作液20 μL混合后于真空濃縮裝置中揮干。依次按“1.2.5”項(xiàng)加入50 μL，0.1 mol·L-1的碳酸氫鈉緩沖液(pH值9.0)和50 μL丹磺酰氯進(jìn)行衍生化反應(yīng)及后續(xù)處理，取上清液5 μL進(jìn)樣分析，記錄各類雌激素的峰面積A2和內(nèi)標(biāo)峰面積AIS2。

C：向離心管中直接加入雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液30 μL(濃度為0.5，2，16 ng·mL-1)、內(nèi)標(biāo)工作液20 μL，真空濃縮揮干。殘?jiān)来伟础?.2.5”項(xiàng)加入50 μL 0.1 mol·L-1的碳酸氫鈉緩沖液(pH值9.0)和50 μL丹磺酰氯進(jìn)行衍生化反應(yīng)及后續(xù)處理，取上清液5 μL進(jìn)樣分析，記錄各類雌激素的峰面積A3和內(nèi)標(biāo)峰面積AIS3。

表3 精密度和準(zhǔn)確度

Tab.3 Accuracy and precision n=6

待測物的提取回收率=A1/A2(mean)×1.3/1.5 ×100%(1.3/1.5為萃取率)

待測物的基質(zhì)效應(yīng)=A2/A3(mean)×100%

內(nèi)標(biāo)的提取回收率=AIS1/AIS2(mean)×1.3/1.5 ×100%(1.3/1.5為萃取率)

內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)=AIS2/AIS3(mean)×100%

計算結(jié)果顯示，采用叔丁基甲醚萃取法，11種雌激素的提取回收率均達(dá)到70%以上，并能保證較低的基質(zhì)干擾。

2.2.5穩(wěn)定性 配制含雌激素低、中、高濃度(50，200，1 600 pg·mL-1)的血清樣本，分別置于室溫24 h、反復(fù)凍融3次、-70 ℃冷凍保存1個月，4 ℃自動進(jìn)樣盤放置24 h，每種處理方式每個濃度平行6份。比較測定樣本的精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示低、中、高濃度的精密度(RSD)和準(zhǔn)確度(RE)均在±15%內(nèi)，如表5所示。

3 討論

隨著研究的深入，各類雌激素的生物學(xué)活性和生理學(xué)意義被不斷地闡明。雌激素被認(rèn)為和神經(jīng)系統(tǒng)[10-11]、心血管系統(tǒng)[12]、骨代謝發(fā)生等關(guān)系密切[13]。在女性圍絕經(jīng)期，雌激素水平顯著降低從而引起圍絕經(jīng)綜合征。國內(nèi)外指南推薦激素補(bǔ)充治療是緩解絕經(jīng)癥狀最有效的方法[14-15]。然而不斷有研究表明，激素補(bǔ)充治療會顯著增加女性患乳腺癌、卵巢癌等疾病的風(fēng)險[16]。因此，體內(nèi)雌激素水平的評價和代謝輪廓的分析對激素補(bǔ)充治療的個體化策略的制定具有重要意義。

自20世紀(jì)60年代以來，免疫法被廣泛運(yùn)用于臨床類固醇激素的檢測中，但其測定種類少、特異性低，且重要的是由于商品化試劑盒的來源、測定方法的差異導(dǎo)致跨實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果存在顯著差異[17]，因此國內(nèi)尚無統(tǒng)一的性激素測定參考值。免疫法對于臨床多中心、跨實(shí)驗(yàn)室的雌激素相關(guān)研究的開展，具有很大局限性。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，LC-MS/MS被逐漸運(yùn)用到類固醇激素多組分分析中，從而使激素測定的種類顯著增多，且特異性和準(zhǔn)確性大大提高。對雌激素的研究，已經(jīng)逐漸從傳統(tǒng)關(guān)注的E2逐漸轉(zhuǎn)向羥化代謝、甲基化代謝等重要代謝途徑與疾病關(guān)聯(lián)性分析中[18-19]。然而，很多有意義的臨床研究所針對的雌激素測定種類少、靈敏度低或分析方法長，不能夠全面而準(zhǔn)確的了解雌激素代謝的整體輪廓[20-23]，故其在相關(guān)疾病的危險因素分析或相關(guān)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)中不能提供很好的數(shù)據(jù)支持。本研究采用了UPLC-MS/MS結(jié)合柱前衍生化技術(shù)成功建立了可同時檢測人血清中包括E1、E2和E3在內(nèi)的11種雌激素的定量分析方法。該方法測定種類多、特異性強(qiáng)、精密度高，且分析時間僅5 min，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)免疫法。基于該方法的雌激素代謝整體輪廓的定量描繪在相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險分析和激素補(bǔ)充治療的個體化策略制定中具有一定的應(yīng)用價值。

表4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

待測物濃度/(pg·mL-1)提取回收率基質(zhì)效應(yīng)%E15091.3±4.697.3±11.920088.8±4.997.9±5.31 60096.2±3.6104.3±6.7E25094.4±2.897.0±4.320095.9±3.594.1±9.01 60087.3±7.7105.4±8.4E35082.5±2.990.2±4.320078.8±11.485.9±9.81 60088.1±2.492.2±3.716epiE35076.3±2.987.7±4.720085.5±6.8114.3±2.51 60089.4±5.3112.6±7.317epiE35081.6±5.1104.4±8.620091.9±8.3103.9±9.81 60091.7±2.798.4±12.92MeOE15074.6±6.398.2±13.720087.8±5.985.0±7.3待測物濃度/(pg·mL-1)提取回收率基質(zhì)效應(yīng)%1 60092.4±5.6104.2±10.94MeOE15093.5±12.689.8±8.320090.9±13.2108.2±8.61 60090.0±9.2111.4±11.016α-OHE15080.1±4.087.9±7.420086.2±6.5102.4±6.21 60095.5±12.794.2±4.32-OHE15081.4±7.775.7±8.220078.2±2.085.1±7.11 60084.4±2.584.4±6.02-OHE25073.5±4.588.1±6.820085.5±3.778.3±11.21 60091.2±11.688.3±2.74-OHE15071.8±9.583.5±3.120091.0±5.480.3±5.01 60088.3±4.288.0±9.8

表5 雌激素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.5 Stability results of the estrogens n=6