謝利軍，楊雨晴，沈葉，應(yīng)玉雯，黃烽如，張燁，劉云，孫魯寧，王永慶

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床藥理研究室，南京 210029；2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥學(xué)部，南京 211166)

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)是人體內(nèi)主要的藥物代謝酶。CYP3A4是人體肝臟中最主要的CYP酶(占總量的60%)[1]，參與超過50%臨床使用藥物的代謝[2]。由于個體間CYP3A4酶活性具有較大的差異[3]，造成藥物療效及不良反應(yīng)存在較大的個體差異[4，5]。為了監(jiān)測治療效果，避免不良反應(yīng)，需要對人體CYP3A4酶的活性進(jìn)行測定[6]。目前，評價人體CYP3A酶活性的方法主要有探針?biāo)幬锓╗7](包括咪達(dá)唑侖試驗、紅霉素呼吸試驗和尿中氨苯砜回收率試驗)和內(nèi)源性生物標(biāo)志物法[6β-羥基氫化可的松/氫化可的松比值[8]及6β-羥基氫化可的松的清除率CLm(6β)[9]]。探針?biāo)幬锓ㄐ枰颊哳~外服用與治療疾病無關(guān)的藥物，可能會引起副作用和藥物相互作用[10]；而且，紅霉素呼吸試驗需要使用放射性同位素[11-12]；另外，咪達(dá)唑侖試驗需要多次采集血液樣本進(jìn)行濃度分析[13]，該方法可在臨床試驗中應(yīng)用，但不宜在臨床診療中采用。6β-羥基氫化可的松和氫化可的松濃度的比值和6β-羥基氫化可的松的清除率CLm(6β)法可以作為評價CYP3A4酶活性的內(nèi)源性生物標(biāo)志物，這種方法具有非侵入性和患者依從性良好等優(yōu)點[14]。

目前報道的測定人尿液中氫化可的松及6β-羥基氫化可的松濃度的分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[15-18]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[19-21]。文獻(xiàn)[15-18]報道的HPLC測定方法，靈敏度較低(定量下限，氫化可的松為5 ng·mL-1，6β-羥基氫化可的松為10 ng·mL-1)、分析時間較長(15～30 min)。文獻(xiàn)[19-21]采用的LC-MS/MS法，前處理過程需要固相萃取后旋干等操作，成本較高且過程復(fù)雜。本文建立了一種簡單快捷的LC-MS/MS法同時測定人尿液樣本中氫化可的松和6β-羥基氫化可的松的濃度，用于評價人體CYP3A4酶活性，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 API 4000質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子源及Analyst1.6.3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國應(yīng)用生物公司)；1290 Infinity高效液相色譜儀，包括G1316C柱溫箱、G4226A多孔板自動進(jìn)樣器和G4220A二元高壓泵(美國安捷倫科技有限公司)；BP211D 電子天平(德國Sartorius公司，感量：0.01 mg)；Stratos離心機(德國Thermo Fisher公司)；Mixmate渦旋混勻儀(德國Eppendorf公司)。

1.2試藥 氫化可的松(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號：41210，純度：99.8%)；6β-羥基氫化可的松(美國Sigma-Aldrich公司，批號：SLBN4942V，純度≥98%)；d4-氫化可的松(加拿大Toronto Research Chemicals公司，批號：5-KSS-11-4，純度：99%)；d4-6β-羥基氫化可的松(加拿大Toronto Research Chemicals公司，批號：1-JMR-119-2，純度：95%)；甲醇為色譜純(美國Merck公司)；甲酸為色譜純(美國Aladdin公司)；超純水(18.2 MΩ)由Millipore純水儀制得。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Waters CORTECS?C18+柱(2.1 mm×50 mm，2.7 μm)；柱溫：40 ℃；流動相由0.1%甲酸水溶液(A相)和甲醇(B相)組成。梯度洗脫：0 min，10%B；0～1 min：10%→40%B；1～3.5 min，40%B；3.5～3.6 min：40%→95%B；3.6～4.5 min：95%B；4.5～4.6 min：95%→10%B；4.6～5 min：10%B；流速：0.6 mL·min-1；進(jìn)樣量：20.0 μL；分析時間5 min。

2.2質(zhì)譜條件 采用多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)離子檢測方式，離子化方式為電噴霧離子化(ESI)，離子極性為正離子，離子化電壓為5500 V，溫度設(shè)為600 ℃，霧化氣壓力為55 N，渦輪氣壓力為55 N，氣簾氣壓力為35 N，碰撞氣壓力為10 N。氫化可的松、6β氫化可的松及其各自內(nèi)標(biāo)的定量離子對，去簇電壓(DP)，射入電壓(EP)，碰撞能量(CE)，碰撞室射出電壓(CXP)見表1。

表1 質(zhì)譜條件

2.3儲備液和工作液的配制 精密稱取氫化可的松10.02 mg對照品(經(jīng)純度換算后相當(dāng)于氫化可的松10.00 mg)用甲醇溶解定容至10.0 mL量瓶，得到1.00 mg·mL-1的氫化可的松儲備液。用50%甲醇水溶解一瓶1.00 mg/瓶的6β-羥基氫化可的松對照品，轉(zhuǎn)移至2.0 mL量瓶并定容，得到500 μg·mL-1的6β-羥基氫化可的松儲備液。取濃度為1.00 mg·mL-1的氫化可的松儲備液20 μL以及500 μg·mL-1的6β-羥基氫化可的松儲備液200 μL至2.0 mL量瓶，并用50%甲醇水定容，得到氫化可的松和6β-羥基氫化可的松濃度分別為10.0/50.0 μg·mL-1的混合工作液，將此混合工作液用50%甲醇水逐級稀釋，得到氫化可的松和6β-羥基氫化可的松濃度分別為0.020 0/0.100，0.040 0/0.200，0.100/0.500，0.400/2.00，1.00/5.00，2.00/10.0，4.00/20.0，5.00/25.0，6.00/30.0 μg·mL-1的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線用混合工作液，以及濃度分別為0.050 0/0.250，0.500/2.50，4.80/24.0 μg·mL-1的質(zhì)控用混合工作液。以甲醇為溶劑，配制含d4-氫化可的松和d4-6β-羥基氫化可的松濃度分別為2.50/12.5 μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)工作液。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣本的配制 由于氫化可的松和6β-羥基氫化可的松為內(nèi)源性物質(zhì)，本研究需要測定待測化合物在尿液樣本中的本底值，故需要選擇合適的替代基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣本。經(jīng)過介質(zhì)效應(yīng)和提取回收率的考察，待測化合物在尿液的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率均在100%附近(具體方法結(jié)果見“2.6.3”和“2.6.4”項下內(nèi)容)，因此，筆者采用水作為替代基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣本。取純水190 μL，加入相應(yīng)濃度的混合工作液10.0 μL，配成含氫化可的松和6β-羥基氫化可的松濃度分別為1.00/5.00，2.00/10.0，5.00/25.0，20.0/100，50.0/250，100/500，200/1000，250/1 250，300/1 500 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本。以及氫化可的松和6β-羥基氫化可的松濃度分別為2.50/12.5，25.0/125，240/1200 ng·mL-1的混合質(zhì)控樣本。根據(jù)美國FDA指導(dǎo)原則，使用尿液基質(zhì)同法制備中、高濃度混合質(zhì)控樣本(氫化可的松和6β-羥基氫化可的松濃度分別為25.0/125和240/1 200 ng·mL-1)，于每一分析批中，以考察生物基質(zhì)中含量測定的可靠性。

2.5樣本前處理 于200 μL尿液樣本中加入內(nèi)標(biāo)甲醇工作液20.0 μL，渦旋10 min，于4 ℃，16 000 r·min-1條件下離心15 min，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.6方法學(xué)驗證

2.6.1專屬性考察 本實驗分別考察了氫化可的松、6β-羥基氫化可的松及其同位素內(nèi)標(biāo)在水基質(zhì)中，以及同位素標(biāo)記的氫化可的松、6β-羥基氫化可的松在人尿液中的專屬性。氫化可的松、6β-羥基氫化可的松、d4-氫化可的松和d4-6β-羥基氫化可的松的保留時間分別約為3.0，1.2，3.0和1.2 min。典型色譜圖如圖1所示，結(jié)果表明水基質(zhì)中氫化可的松，6β-羥基氫化可的松及其內(nèi)標(biāo)峰位處無干擾，尿液中d4-氫化可的松和d4-6β-羥基氫化可的松峰位處無干擾。

2.6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線 按“2.4”項方法制備混合標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本和混合質(zhì)控樣本。按“2.5”項下處理樣本。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，以待測化合物/內(nèi)標(biāo)峰面積比值(f)為縱坐標(biāo)，用權(quán)重系數(shù)1/C2進(jìn)行最小二乘法線性回歸。典型的氫化可的松及6β-羥基氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為f=0.004 27×C+0.000 161(r=0.999 3)及f=0.004 61×C+0.001 52(r=0.998 8)，結(jié)果表明分別在1～300 ng·mL-1及5～1500 ng·mL-1范圍線性良好。

2.6.3提取回收率 按“2.4”項方法，使用6個不同來源的空白尿液制備低濃度(氫化可的松/6β-羥基氫化可的松，2.50/12.5 ng·mL-1)、中濃度(氫化可的松/6β-羥基氫化可的松，25.0/125 ng·mL-1)、高濃度(氫化可的松/6β-羥基氫化可的松，240/1200 ng·mL-1)混合質(zhì)控樣本，按“2.5”項下處理。同時在6個不同來源的空白尿液的甲醇提取液加入相同濃度的分析物和內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻。上述每個濃度樣本配制3份，進(jìn)樣分析后，以空白尿液制備的樣本中分析物的峰面積與空白尿液的甲醇提取液制備的樣本中分析物的峰面積的比值，評價提取回收率。結(jié)果顯示3種濃度尿液樣本中氫化可的松的提取回收率分別為(100.8±9.6)%，(100.1±2.8)%，(108.3±5.3)%，6β-羥基氫化可的松的提取回收率為(97.2±0.8)%，(97.4±6.8)%，(101.9±4.5)%。

A.空白樣本；B.中濃度質(zhì)控水基質(zhì)樣本；C.空白尿液樣本；D.僅含內(nèi)標(biāo)的尿液基質(zhì)樣本

1.blank sample；B.quality control sample at medium dose；C.blank urine sample；D.Urine sample containing internal standard

Fig.1Chromatogramsofhydrocortisone，6β-hydroxycortisoneandtheirinternalstandardsinwaterandurine

2.6.4基質(zhì)效應(yīng) 按“2.4”和“2.5”項方法，使用6個不同來源的空白尿液制備甲醇提取液，加入待測化合物和內(nèi)標(biāo)工作液，制備濃度為中濃度和高濃度質(zhì)控的基質(zhì)效應(yīng)樣本；同時用水基質(zhì)制備相同的中濃度和高濃度樣本；另外，對6個不同來源的尿液分別配制空白尿液甲醇提取液，僅加入內(nèi)標(biāo)工作液，用于計算空白尿液基線值；上述樣本每個來源每個濃度各配制3份。將上述樣本進(jìn)樣分析，得到各樣本待測化合物與內(nèi)標(biāo)的峰面積，計算待測化合物/內(nèi)標(biāo)峰面積比值(f)；將基質(zhì)效應(yīng)樣本中的f值減去空白尿液f值(基線值)后除以水基質(zhì)樣本中的f值，獲得扣除基線值的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子，用于評價尿液基質(zhì)對分析的影響。中濃度和高濃度尿液樣本中氫化可的松的基質(zhì)效應(yīng)分別是(95.8±8.0)%，(97.7±4.8)%，6β-羥基氫化可的松的基質(zhì)效應(yīng)分別是(95.6±8.1)%，(106.0±6.2)%，結(jié)果顯示尿液基質(zhì)不影響樣本檢測，同時結(jié)合提取回收率結(jié)果驗證了可以水溶液作為替代基質(zhì)。

2.6.5準(zhǔn)確度和精密度 按“2.4”項方法配制定量下限樣本、低中高濃度的水基質(zhì)混合質(zhì)控樣本以及低高兩種濃度的尿液基質(zhì)混合質(zhì)控樣本，每個濃度配制5份，按“2.5”項下處理，考察批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果見表2。

2.6.6穩(wěn)定性實驗 按“2.4”項方法，配制濃度為低、高兩種濃度的水基質(zhì)混合質(zhì)控樣本，及濃度為中高兩種濃度的尿液基質(zhì)混合質(zhì)控樣本，分別在室溫(24 ℃)放置10 h、自動進(jìn)樣器(10 ℃)中放置24 h、反復(fù)凍融3次、-80 ℃冰凍3個月后，按“2.5”方法處理，以準(zhǔn)確度評估穩(wěn)定性。結(jié)果顯示待測化合物在上述條件下穩(wěn)定性均良好，見表3。

表2 精密度和準(zhǔn)確度

COR表示氫化可的松；6β-OH COR表示6β-羥基氫化可的松。

Cor，cortisol；6β-OH COR，6β-hydroxycortisol.

2.7人尿液中氫化可的松和6β-羥基氫化可的松濃度的測定 6β-羥基氫化可的松和氫化可的松濃度的比值和6β-羥基氫化可的松的清除率CLm(6β)[9]作為評價人體CYP3A4酶活性的內(nèi)源性生物標(biāo)志物，具有非侵入性和患者依從性良好等優(yōu)點[14]。西他沙星主要經(jīng)UGT1A代謝消除[22]，不是CYP的底物，對CYP酶沒有誘導(dǎo)和抑制作用[23]，故可以在研究西他沙星在健康受試者體內(nèi)尿藥排泄的同時，研究健康受試者尿液中6β-羥基氫化可的松和氫化可的松濃度的比值的經(jīng)時變化情況及清除率，為人體CYP3A4酶活性的內(nèi)源性生物標(biāo)志物研究提供數(shù)據(jù)。

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

COR表示氫化可的松；6β-OH COR表示6β-羥基氫化可的松。

Cor，cortisol；6β-OH COR，6β-hydroxycortisol.

西他沙星顆粒劑在健康受試者體內(nèi)的藥動學(xué)(臨床試驗批件號：2014L00334)在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院Ⅰ期臨床試驗病房完成。其中，50 mg劑量組單次給藥藥動學(xué)研究，于給藥前和給藥后10，20，30，45 min，1.0，1.25，1.5，2，3，5，8，12，24，36 h采集靜脈血進(jìn)行人體藥動學(xué)研究；于給藥前和給藥后0～3，3～6，6～12，12～24，24～36，36～48，48～60 h收集尿樣樣本進(jìn)行西他沙星顆粒劑尿液排泄研究。

本文應(yīng)用已建立的方法測定西他沙星顆粒劑50 mg劑量組單次給藥前后(0～24 h)人尿液中6β-羥基氫化可的松和氫化可的松的濃度；應(yīng)用已建立的測定人血漿中6β-羥基氫化可的松和氫化可的松濃度方法(另文發(fā)表)，測定西他沙星顆粒劑50 mg劑量組單次給藥前后(0～24 h)人血漿中6β-羥基氫化可的松和氫化可的松的濃度；分別計算人尿液中6β-羥基氫化可的松和氫化可的松濃度的比值和6β-羥基氫化可的松的清除率CLm(6β)[9](CLm(6β)=X(6β)/ AUC(F)，其中，X(6β)為不同集尿時間段尿中6β-羥基氫化可的松的排泄量；AUC(F)為相應(yīng)時間段內(nèi)氫化可的松的血藥濃度-時間曲線下面積。10例受試者單次給定西他沙星顆粒劑50 mg后(0～24 h)尿液中6β-羥基氫化可的松和氫化可的松濃度的比值的經(jīng)時過程見圖2，尿液樣本中6β-羥基氫化可的松的清除率CLm(6β)為(2.46±1.03)mL·min-1，與文獻(xiàn)報道[24]健康受試者結(jié)果接近。

3 討論

筆者在研究建立并驗證了同時測定人尿液中氫化可的松及6β-羥基氫化可的松的HPLC-MS/MS法。在方法開發(fā)過程中，對每項質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，使得兩個待測化合物均具有現(xiàn)有條件下最高的質(zhì)譜響應(yīng)。優(yōu)化色譜條件時，對不同的色譜柱，不同的流動相的組成、比例、流速進(jìn)行了對比，選擇峰形和分離均較好的色譜柱和色譜條件，同時建立了梯度洗脫程序，在實現(xiàn)良好的色譜分離的同時，在待測化合物出峰后使用95%有機相沖洗1 min以保護(hù)色譜柱和減少本次進(jìn)樣對下一次進(jìn)樣的影響，以提高方法的耐用性。由于氫化可的松和6β-羥基氫化可的松為內(nèi)源性物質(zhì)，本研究需要測定待測化合物在尿液樣本中的本底值，故需要選擇合適的替代基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣本。在方法驗證過程中，經(jīng)過介質(zhì)效應(yīng)和提取回收率的考察，充分驗證了水作為替代基質(zhì)的可行性。由于基質(zhì)中氫化可的松和6β-羥基氫化可的松本底量高，而低濃度質(zhì)控樣本濃度相對較低，無法準(zhǔn)確扣除本底量，因此只考察了中、高兩種濃度質(zhì)控樣本的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示無明顯基質(zhì)效應(yīng)。在提取回收率實驗中，用來對比的兩種樣本中均含有尿液基質(zhì)，所以無需扣除本底量，結(jié)果顯示提取回收率接近100%。另外，根據(jù)FDA指導(dǎo)原則，在每一分析批中額外加入了中、高兩種濃度的尿液基質(zhì)質(zhì)控樣本，以驗證分析結(jié)果的可靠性。最終應(yīng)用建立的同時測定人尿液中氫化可的松和6β-羥基氫化可的松濃度的HPLC-MS/MS法用于人體CYP3A酶活性評價。

圖2 尿液中6β-羥基氫化可的松和氫化可的松濃度的比值的經(jīng)時過程

Fig.2Curvesofconcentrationratioof6β-hydroxycortisonetohydrocortisoneinhumanurineversustime