李 響，都珊珊

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 干部病房，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 心血管外科)

主動(dòng)脈夾層是較為罕見的一種致死性疾病，其發(fā)病急進(jìn)展快，因急診以胸痛癥狀為主要就診原因的患者較多，通常會(huì)考慮急性心肌梗死或是肺栓塞、氣胸等疾病，導(dǎo)致誤診從而耽誤患者的診療過程[1]。目前針對(duì)主動(dòng)脈夾層的特異性血清診斷標(biāo)志物尚未出現(xiàn)[2]。現(xiàn)有研究證實(shí)Cdc20參與廣泛疾病的細(xì)胞周期過程[3]，但其是否能夠作為主動(dòng)脈夾層的血清診斷標(biāo)志物目前尚不明確。本文通過高通量生物信息學(xué)工具對(duì)基因芯片進(jìn)行分析處理并通過主動(dòng)脈夾層組織標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證來明確Cdc20在主動(dòng)脈夾層的診療過程中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2016年1月—2018年12月就診于我院的主動(dòng)脈夾層患者45例。所有患者均經(jīng)主動(dòng)脈CTA檢查確診為主動(dòng)脈夾層Stanford A型患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有昏迷、出血傾向等手術(shù)禁忌癥患者，保守治療及未行手術(shù)或拒絕治療的患者。②遺傳性主動(dòng)脈夾層包括馬凡綜合征或特納(Turner)綜合征或埃-當(dāng)(Ehlers-Danlos)綜合征。其中男25例，女20例，平均年齡48.1±11.1歲。對(duì)照組為同期行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)患者經(jīng)打孔器搜集的正常升主動(dòng)脈組織41例。入組病例一般基本資料詳見表1。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)吉林大學(xué)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，全部患者對(duì)手術(shù)標(biāo)本去向及用途知情并同意將標(biāo)本作為科研使用。

表1 2組患者一般資料比較

注：P均>0.05；表中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或例(%)表示

1.2 高通量生物信息分析方法編碼RNA芯片表達(dá)結(jié)果GSE52093來源于GEO數(shù)據(jù)庫(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。其中GSE52093包含7例主動(dòng)脈夾層組織和5例捐獻(xiàn)者正常的升主動(dòng)脈組織。通過GEO2R軟件進(jìn)行差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析，差異表達(dá)篩選標(biāo)準(zhǔn)為(差異倍數(shù)在2倍以上及P<0.05)。Graphpad prism 7進(jìn)行差異基因的火山圖繪制。STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，其中可信度分?jǐn)?shù)定義在大于0.9為有意義改變。將STRING軟件分析得到的高通量數(shù)據(jù)分析結(jié)果進(jìn)行包括基因本體分析(GO analysis)和京都基因及基因組百科全書信號(hào)通路分析(KEGG analysis)。Cytoscape軟件將STRING軟件分析得到的結(jié)果進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖繪制及cytoHubba關(guān)鍵基因的預(yù)測(cè)，篩選標(biāo)準(zhǔn)degree cutoff = 2,node score cutoff = 0.2,k-core = 2,and max depth = 100。

1.3全部患者升主動(dòng)脈標(biāo)本進(jìn)行RNA提取(TIANDZ試劑盒)。RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA采用All In One cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。實(shí)時(shí)定量PCR操作儀器為ABI公司生產(chǎn)的7500 Real time PCR機(jī)器，每組樣品均設(shè)3 個(gè)重復(fù)。Cdc20引物及GAPDH由Primer Blast設(shè)計(jì)，并經(jīng)Oligo 7軟件驗(yàn)證，引物序列：GAPDH(forward):CGGACCAATACGACCAA-ATCCG；GAPDH(reverse):AGCCACATCGCTCA-GACACC。Cdc20(forward):ATGCGCCAGAGGG-TTATCAG；Cdc20(reverse):AGGATGTCACCAGAGCTTGC。

2 結(jié)果

2.1芯片分析結(jié)果顯示總共對(duì)47203個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，其中43039個(gè)基因無明顯變化，1866個(gè)下調(diào)差異性表達(dá)的基因，2288個(gè)上調(diào)差異性表達(dá)的基因。對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行火山圖差異表達(dá)基因繪制，其中圓點(diǎn)代表無明顯差異基因，圓圈代表差異上調(diào)基因，菱形代表差異下調(diào)基因，顯示如圖1。

2.2基因本體分析結(jié)果顯示差異基因主要富集在細(xì)胞周期的調(diào)控和平滑肌細(xì)胞收縮功能，細(xì)胞成分主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)，分子功能富集在肌肉結(jié)構(gòu)成分。京都基因及基因組百科全書信號(hào)通路分析顯示差異性表達(dá)的基因主要涉及細(xì)胞周期和DNA復(fù)制。全部差異表達(dá)基因經(jīng)STRING處理后得到的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作分析數(shù)據(jù)，然后導(dǎo)入Cytoscape軟件所得分析結(jié)果如圖2，其中基因名稱的大小以及基因所處背景大小根據(jù)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果中的Degree程度呈現(xiàn)漸進(jìn)性改變。cytoHubba軟件對(duì)全部差異表達(dá)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Cdc20為相關(guān)度最高的基因(dgree=37)。

圖1 主動(dòng)脈夾層組織與正常組織差異表達(dá)基因火山圖

注：其中圓點(diǎn)代表無明顯差異基因，圓圈代表差異上調(diào)基因，菱形代表差異下調(diào)基因。

2.3在獲取的主動(dòng)脈夾層和冠心病升主動(dòng)脈組織中驗(yàn)證，Cdc 20 在2組織中均呈現(xiàn)差異性表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn) Cdc 20在夾層組和對(duì)照組之間呈現(xiàn)差異性高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖2 差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)互作分析圖

注：基因名稱的大小以及基因所處背景大小根據(jù)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果中的Degree程度呈現(xiàn)漸進(jìn)性改變，相關(guān)度評(píng)分越高，字體顏色越黑，藍(lán)色背景越大。

3 討論

主動(dòng)脈夾層是血液通過內(nèi)膜破口并在血壓的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入血管內(nèi)膜和中層之間而導(dǎo)致的一種撕裂樣疼痛性疾病[4]。其臨床多以胸部劇烈疼痛為首要就診癥狀[5]。雖然胸痛三聯(lián)檢查冠狀動(dòng)脈-肺動(dòng)脈-主動(dòng)脈血管造影目前對(duì)主動(dòng)脈夾層的檢出率有所提高，但尚未在全部醫(yī)院普及。血清學(xué)檢查作為較為普遍、快速和廉價(jià)的檢查方式之一在臨床以及所有醫(yī)院都能廣泛應(yīng)用。特別是血清學(xué)診斷標(biāo)志物如心肌損傷標(biāo)志物、腦鈉肽、心肌酶學(xué)、D二聚體[6]等在心肌梗死、心衰、血栓性疾病的診斷上有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但目前尚無主動(dòng)脈夾層的特異性血清診斷標(biāo)志物應(yīng)用臨床。

圖3 RT-pcr檢測(cè)Cdc 20在夾層組及對(duì)照組織的表達(dá)量

研究發(fā)現(xiàn)，在一些疾病的發(fā)展早期，存在于正常組織和病變組織中的RNA已經(jīng)發(fā)生改變，對(duì)這些特定的RNA檢查能夠起到早期的診斷作用，甚至可以進(jìn)行特定的干預(yù)來預(yù)防疾病的發(fā)生和發(fā)展[7]。因此越來越多的研究將主動(dòng)脈夾層的早期血清診斷標(biāo)志物作為研究的熱點(diǎn)，也發(fā)現(xiàn)了較多的具有診斷價(jià)值的RNA診斷標(biāo)志物。但是高通量數(shù)據(jù)分析也會(huì)出現(xiàn)許多錯(cuò)誤的生物學(xué)信息，需要不斷的進(jìn)行分析來排除干擾并需要經(jīng)過組織學(xué)驗(yàn)證。故本文在前人基因芯片結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步的高通量生物信息學(xué)分析及組織標(biāo)本驗(yàn)證，來明確Cdc20在主動(dòng)脈夾層中的診療價(jià)值。

通過對(duì)GSE52093基因芯片中差異性表達(dá)的基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，主要的差異基因匯集在平滑肌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期調(diào)控方面。進(jìn)一步將全部的差異表達(dá)基因進(jìn)行STRING分析得到蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)后，在對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行cytoHubba分析后發(fā)現(xiàn)Cdc20為最為關(guān)鍵的差異基因，而細(xì)胞周期為最關(guān)鍵的信號(hào)通路。Cdc20是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期因子之一，其主要功能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白B(Cyclin B)和細(xì)胞周期調(diào)控因子p21來影響細(xì)胞周期,并能影響Wnt/β連環(huán)信號(hào)傳導(dǎo)通路和Nek2A以及Kif18A通路。Cdc20同時(shí)還能耗盡內(nèi)源性phf8從而導(dǎo)致細(xì)胞G2周期的延長而使有絲分裂缺陷最終影響細(xì)胞周期[8]。而已有大量研究指出平滑肌細(xì)胞的增殖周期以及遷移能力的改變是主動(dòng)脈夾層的重要發(fā)病機(jī)制。而我們的研究和既往文獻(xiàn)結(jié)果均確認(rèn)平滑肌細(xì)胞的增殖周期在主動(dòng)脈夾層的發(fā)病過程中起到主要作用，并且通過組織標(biāo)本驗(yàn)證Cdc20在主動(dòng)脈夾層的升主動(dòng)脈組織中均呈現(xiàn)差異性表達(dá)，具有一定的可信度。

總之，Cdc20作為細(xì)胞周期通路中的關(guān)鍵因子，在主動(dòng)脈夾層的診斷中具有潛在診療價(jià)值。針對(duì)Cdc20不僅能對(duì)主動(dòng)脈夾層的診斷起到提示作用，對(duì)其早期檢測(cè)，更可能對(duì)主動(dòng)脈夾層易感人群進(jìn)行篩查，從而制定降壓等干預(yù)措施達(dá)到早期診斷及治療的效果。