盧光輝，孫綱，劉子源，徐鵬，邵潤東，陳琦，鮑豐羽

1錦州醫(yī)科大學(xué)中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六七醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧大連116021；2中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六七醫(yī)院

人肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年增加[1，2]。我國每年約36.9萬人死于肝癌，約占全球肝癌死亡病例總數(shù)的47.2%。由于缺乏早期敏感的診斷標(biāo)志物及方法，HCC通常于晚期確診，預(yù)后不良，患者5年生存率低于7%[4]。因此，如何更好地明確HCC發(fā)生的分子機(jī)制、尋找早期診斷方法、改進(jìn)治療方案是相關(guān)研究的重點(diǎn)。三結(jié)構(gòu)域蛋白59(TRIM59)是一種存在于不同腫瘤細(xì)胞中的新型生物標(biāo)志物[5～8]，其具有高度結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及廣泛的生物學(xué)活性。TRIM59被認(rèn)為是一種癌基因，TRIM59的過表達(dá)可能參與細(xì)胞中一些致癌基因的突變，導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展[9]。關(guān)于TRIM59在HCC細(xì)胞中的作用及功能，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道尚少。2018年12月～2019年2月，本研究觀察了TRIM59在不同HCC細(xì)胞中的表達(dá)變化，及其對細(xì)胞增殖、p53蛋白表達(dá)的影響，探討可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 6種HCC細(xì)胞系(Huh7、Hep3B、HepG2、SK-Hep1、BEL7402、SMMC7721)及人正常肝細(xì)胞系LO2均購自ATCC公司。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、EMEM、DMEM、10%胎牛血清購自GIBCO公司。1%青霉素-鏈霉素購自Beyotime公司。小鼠E17 cDNA文庫來自Clontech實(shí)驗(yàn)室。脂質(zhì)體3000購自Invitrogen公司?？筎RIM59及TRIM59的慢病毒顆粒購自Santa Cruz公司。pcDNA3.1-TRIM59質(zhì)粒和pcDNA3.1-Vector對照質(zhì)粒購自Gene Copoeia公司。普羅霉素購自Sigma公司?？筽53和GAPDH購自Cell Signaling Technology公司。RNeaseMini試劑盒購自QIAGEN公司。SsoFastEvaGreen超級混合物、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。裂解緩沖液購自Roche公司。

1.2 HCC細(xì)胞與正常肝細(xì)胞中TRIM59 mRNA及蛋白檢測 用RNeaseMini試劑盒從細(xì)胞中提取總RNA。采用qRT-PCR法檢測TRIM59 mRNA。PCR反應(yīng)體積10 μL，包括SsoFast EvaGreen超級混合物5 μL、cDNA模板1 μL、兩對引物各1 μL。TRIM59 mRNA上游引物序列為5′-TACGAGAGCAGCTGGAA-3′，下游引物序列為5′-ACGGGTTGAACCTCAGGAAG-3′。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。目標(biāo)基因的表達(dá)針對內(nèi)參基因house keeping水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，表示TRIM59 mRNA相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Western blotting法檢測HCC細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞中的TRIM59蛋白，以GAPDH為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，使用Image J軟件進(jìn)行圖像處理，分析灰度值。

1.3 TRIM59對HCC細(xì)胞增殖及p53蛋白表達(dá)影響觀察

1.3.1 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 選擇預(yù)實(shí)驗(yàn)中TRIM59 mRNA和蛋白表達(dá)水平相對較高的HepG2、Huh7細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將HepG2細(xì)胞分為shTRIM59組和shControl組，shTRIM59組感染TRIM59慢病毒，shControl組感染TRIM59慢病毒陰性對照。將Huh7細(xì)胞分為pcDNA3.1-TRIM59組和pcDNA3.1-Vector組；采用PCR法從小鼠E17 cDNA文庫中擴(kuò)增TRIM59，將含有TRIM59 cDNA的片段亞克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒上；用脂質(zhì)體3000將pcDNA3.1-TRIM59質(zhì)粒和陰性對照分別導(dǎo)入至pcDNA3.1-TRIM59組和pcDNA3.1-Vector組Huh7細(xì)胞。感染或轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。提取各實(shí)驗(yàn)組總RNA和蛋白。采用Western blotting法檢測TRIM59蛋白。shTRIM59組、shControl組的HepG2細(xì)胞中TRIM59蛋白相對表達(dá)量分別為0.46±0.06、1.03±0.02(P<0.05)。pcDNA3.1-TRIM59組、pcDNA3.1-Vector組的Huh7細(xì)胞中TRIM59蛋白相對表達(dá)量分別為0.60±0.01、0.13±0.01(P<0.05)。表明兩種細(xì)胞均感染或轉(zhuǎn)染成功。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力檢測 取感染或轉(zhuǎn)染后的兩種HCC細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，按1×103/孔平鋪于6孔板內(nèi)，于37 ℃、5%CO2條件下在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每3 d更換1次培養(yǎng)基，約14 d后形成肉眼可見的細(xì)胞集落(每個(gè)集落≥50個(gè)細(xì)胞)。用0.1%結(jié)晶紫染色，光學(xué)顯微鏡下計(jì)算集落形成數(shù)，表示細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，使用Image J軟件進(jìn)行圖像處理。

1.3.3 p53蛋白檢測 當(dāng)兩種HCC細(xì)胞融合率達(dá)到90%時(shí)，提取總蛋白，并用Bradford法進(jìn)行鑒定。用聚丙烯酰胺電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜之后，將硝酸纖維素濾膜(NC)與一抗共同孵育，4 ℃過夜，TBST洗膜3次。加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。ECL發(fā)光液顯影，以GAPDH為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 HCC細(xì)胞、正常肝細(xì)胞中TRIM59 mRNA及蛋白表達(dá)比較 BEL7402、Hep3B、HepG2、Huh7、SMMC7721、SK-Hep1、LO2細(xì)胞中TRIM59 mRNA相對表達(dá)量分別為10.86±0.97、8.74±0.23、62.41±7.53、63.99±5.91、30.51±3.21、9.99±0.20、0.03±0.01，TRIM59蛋白相對表達(dá)量分別為0.14±0.01、0.13±0.02、0.68±0.04、0.72±0.03、0.33±0.02、0.12±0.02、0.00±0.01，各HCC細(xì)胞中TRIM59 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均高于LO2細(xì)胞(P均<0.05)。在6種HCC細(xì)胞系中，HepG2細(xì)胞TRIM59 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均高于BEL7402、Hep3B、SMMC7721、SK-Hep1細(xì)胞(P均<0.05)；Huh7細(xì)胞TRIM59 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均高于BEL7402、Hep3B、SMMC7721、SK-Hep1細(xì)胞(P均<0.05)。選取HepG2細(xì)胞及Huh7細(xì)胞為下一階段的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

2.2 TRIM59對HepG2、Huh7細(xì)胞增殖能力的影響 shControl組、shTRIM59組HepG2細(xì)胞集落形成數(shù)分別為(137.00±2.65)、(57.67±2.01)個(gè)，shTRIM59組集落形成數(shù)低于shControl組(P<0.05)。pcDNA3.1-Vector組、pcDNA3.1-TRIM59組Huh7細(xì)胞集落形成數(shù)分別為(87.67±2.52)、(150.33±1.15)個(gè)，pcDNA3.1-TRIM59組集落形成數(shù)高于pcDNA3.1-Vector組(P均<0.05)。見圖1。

2.3 TRIM59對HepG2、Huh7細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)的影響 shControl組、shTRIM59組HepG2細(xì)胞中p53蛋白相對表達(dá)量分別為0.71±0.05、1.32±0.06，shTRIM59組p53蛋白相對表達(dá)量高于shControl組(P<0.05)。pcDNA3.1-Vector組、pcDNA3.1-TRIM59組Huh7細(xì)胞中p53蛋白相對表達(dá)量分別為0.93±0.02、0.77±0.03，pcDNA3.1-TRIM59組p53蛋白相對表達(dá)量低于pcDNA3.1-Vector組(P<0.05)。

3 討論

注：A為shControl組；B為shTRIM59組；C為pcDNA3.1-Vector組；D為pcDNA3.1-TRIM59組。

圖1 TRIM59表達(dá)對HepG2、Huh7細(xì)胞增殖能力的影響

HCC在肝臟疾病中占有相當(dāng)一部分比例[10]。HCC早期無典型臨床表現(xiàn)，惡性度高、轉(zhuǎn)移率高、復(fù)發(fā)率高，多數(shù)患者一經(jīng)確診就已發(fā)展為進(jìn)展性，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)期。加之部分腫瘤細(xì)胞先天或后天的耐藥性，多數(shù)患者經(jīng)規(guī)范化手術(shù)治療聯(lián)合術(shù)后化療后預(yù)后仍不樂觀[11，12]。從分子生物學(xué)層面解讀HCC的發(fā)病機(jī)制，尋找更有效的治療方法尤為重要。作為一種新發(fā)現(xiàn)的癌基因，TRIM59有著典型的RBCC結(jié)構(gòu)域，即從N端到C端依次為鋅指結(jié)構(gòu)域(RING finger)、B-BOX結(jié)構(gòu)域、卷曲螺旋(Coiledcoil)結(jié)構(gòu)域[13]，被證明存在于不同的腫瘤細(xì)胞中，并參與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的調(diào)控[14～16]。但是，TRIM59在HCC中的表達(dá)情況及具體作用機(jī)制少見報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞相比，HCC細(xì)胞中TRIM59 mRNA高表達(dá)。上調(diào)HepG2細(xì)胞中TRIM59表達(dá)后，HCC細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)；降低Huh7細(xì)胞中TRIM59表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力明顯減弱。由此可見，TRIM59高表達(dá)有利于HCC細(xì)胞的增殖。

為進(jìn)一步探究TRIM59對HCC細(xì)胞的作用機(jī)制，我們查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，TRIM59在胃癌細(xì)胞中可促進(jìn)p53的泛素化和降解[17]，從而使p53失去了對細(xì)胞增殖的抑制而導(dǎo)致胃癌；TRIM59可通過對p53的泛素化和降解而導(dǎo)致一些腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[18，19]。而在HCC細(xì)胞中，TRIM59能否對p53的表達(dá)產(chǎn)生影響仍不明確。本研究通過調(diào)節(jié)TRIM59在HCC細(xì)胞中的表達(dá)，探討TRIM59的作用及與p53的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，上調(diào)Huh7細(xì)胞中TRIM59表達(dá)后，p53表達(dá)水平明顯下調(diào)；而下調(diào)HepG2細(xì)胞中TRIM59表達(dá)后，p53表達(dá)水平顯著上調(diào)。這表明干預(yù)HCC細(xì)胞中TRIM59的表達(dá)后，p53的表達(dá)可相應(yīng)發(fā)生改變，提示TRIM59可能通過調(diào)節(jié)p53信號通路進(jìn)而對HCC細(xì)胞產(chǎn)生影響。

p53作為一種廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞中的抑癌基因，可通過對細(xì)胞周期進(jìn)程的阻斷和促使細(xì)胞凋亡來有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長，阻遏惡性腫瘤的進(jìn)展[20]。人類MDM2同源基因是一種可在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的E3泛素連接酶，它能與p53結(jié)合并輔助p53在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生降解，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)p53降解最重要的一種泛素連接酶，是p53的抑制因子。從分子結(jié)構(gòu)來看，在降解p53的過程中，MDM2的RING結(jié)構(gòu)域起到了主要作用，而TRIM59在其N末端也有著類似的RING結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)相似性表明TRIM59和MDM2在對p53的調(diào)控中可能也有著類似的機(jī)制。因此推測，在HCC中TRIM59的RING結(jié)構(gòu)域可能與p53存在著某種關(guān)聯(lián)，促使p53發(fā)生降解。高表達(dá)的TRIM59可能通過上述途徑降解p53，p53低表達(dá)失去對HCC細(xì)胞的抑制作用而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長；相反，低表達(dá)的TRIM59不足以降解p53，p53高表達(dá)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、抑制了HCC的進(jìn)展。

綜上所述，HCC細(xì)胞中TRIM59 mRNA及蛋白高表達(dá)；上調(diào)TRIM59表達(dá)，HCC增殖能力增強(qiáng)、p53低表達(dá)，下調(diào)TRIM59表達(dá)則HCC增殖能力減弱、p53高表達(dá)；TRIM59對HCC細(xì)胞增殖的影響可能是通過調(diào)節(jié)p53表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。具體影響機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。