康萍，蔣茜，毛朝明，劉佳夢，丁超，董利陽

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212001

大顆粒性淋巴細胞白血病(LGLL)是一種罕見的慢性成熟淋巴細胞增殖性疾病，其特征是原因不明的CD3+T/CD3-NK細胞的單克隆增殖[1]。大顆粒淋巴細胞的形態(tài)特征為胞體變大，細胞核腎型或者半圓型，胞質(zhì)增多，內(nèi)含有豐富的嗜天青顆粒[2]。通常，形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分病理性單克隆增殖的大顆粒淋巴細胞和生理反應(yīng)性多克隆增殖的大顆粒淋巴細胞[3，4]。LGLL的臨床診斷復(fù)雜且費時，沒有標(biāo)準(zhǔn)、有效的治療方案，因此需要尋找新的免疫標(biāo)志物協(xié)助快速診斷及治療。信號淋巴細胞活化分子家族7(SLAMF7)是一種糖基化的細胞表面蛋白，是信號淋巴細胞活化分子(SLAM)家族的成員[5]。SLAMF7除了在正常的NK細胞、部分T細胞亞群、活化的B細胞、漿細胞表達外，還表達在一些造血系統(tǒng)腫瘤細胞中[6]。越來越多的研究表明，SLAMF7在多種疾病中發(fā)揮重要作用，抗SLAMF7的單克隆抗體埃羅妥珠單抗(Elotuzumab)已成功用于多發(fā)性骨髓瘤的臨床治療[7]，而關(guān)于SLAMF7和LGLL的研究較少。2015年3月～2019年8月，本研究觀察了LGLL患者外周血淋巴細胞中SLAMF7的表達，及其與嗜天青大顆粒主要成分顆粒酶B(Granzyme B)和穿孔素(Perforin)表達水平的相關(guān)性，為尋找LGLL新的診斷指標(biāo)及治療靶點提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月～2019年8月就診于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院的LGLL患者9例(病例組)進入研究，男7例、女2例，年齡52～69歲，T大顆粒淋巴細胞白血病(T-LGLL)6例、NK大顆粒淋巴細胞白血病(NK-LGLL)3例?；颊呔螸GLL的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，至少滿足以下3個條件：①血液中存在大顆粒淋巴細胞(>500/μL)長于6個月，或大顆粒淋巴細胞數(shù)目較低但為單克隆性，且患者表現(xiàn)出其他典型的臨床或血液學(xué)特征，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或細胞減少癥；②具有典型的免疫表型，如T-LGLL典型免疫表型為CD3+CD8+CD57+，NK-LGLL為CD3-CD8+CD16+CD56+；③PCR或流式細胞術(shù)分析T細胞受體(TCR)基因重排確認(rèn)T細胞克隆性，殺傷性免疫球蛋白樣受體(KILR)激活亞型限制性表達表示NK細胞單克隆擴增[9，10]。同時招募15例年齡、性別相匹配且無造血系統(tǒng)疾病、無自身免疫性疾病和活動性感染的健康志愿者作為對照組。本研究獲得江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，患者均對研究方案知情同意。

1.2 病例組和對照組外周血淋巴細胞中SLAMF7檢測 取兩組EDTA-K2抗凝的外周全血100 μL，用PerCp Cy5.5偶聯(lián)抗人CD3抗體、FITC偶聯(lián)CD8抗體、PE偶聯(lián)SLAMF7抗體、BV510偶聯(lián)抗人CD45抗體、BV421偶聯(lián)抗CD56抗體及Alexa Fluor 647偶聯(lián)抗人SLAMF7抗體、APC efluor 780偶聯(lián)FVD抗體染色(用于標(biāo)記死亡細胞)，加入1 mL稀釋后的紅細胞裂解液靜置10 min，離心去上清以去除紅細胞后，用PBS洗滌2次，用400 μL的PBS重懸，上FACS Caliber流式細胞儀檢測。以CD45/SSC-A設(shè)門篩選出活淋巴細胞，進一步篩選細胞毒性T細胞(CD3+CD8+)和NK細胞(CD3-CD56+)后，分析SLAMF7陽性細胞。采用FlowJo10.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。每組樣本重復(fù)檢測3次，取均值。

1.3 病例組與對照組淋巴細胞形態(tài)觀察 取兩組EDTA-K2抗凝的外周血以制作頭、體、尾分明的血涂片若干張，自然干燥后，滴加5滴瑞氏-吉姆薩染液1 min后滴加10滴pH 6.4的PBS輕輕晃動載玻片，室溫靜置15 min，流水沖去多余染液，干燥后于顯微鏡下觀察淋巴細胞形態(tài)。

1.4 病例組大顆粒淋巴細胞Granzyme B、Perforin檢測 取病例組EDTA-K2抗凝的外周血100 μL，以“1.2”步驟進行表面抗體染色后，按照說明書進行細胞內(nèi)Granzyme B、Perforin染色，流式細胞儀檢測Granzyme B、Perforin陽性細胞，每組樣本重復(fù)檢測3次，取均值。

1.5 慢性活化淋巴細胞模型制作及SLAMF7表達觀察 取對照組EDTA-K2抗凝的外周血10 mL，利用Ficoll密度梯度離心法從人淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞(PBMC)，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基將PBMC濃度調(diào)整為1×106/mL。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選擇0.5 μg/mL的植物血凝素(PHA)制作慢性活化淋巴細胞模型。將1×106個PBMC接種于24孔板，加入含0.5 μg/mL PHA、100 U/mL IL-2的無血清培養(yǎng)基750 μL，分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h收集細胞，參照“1.2”方法，采用流式細胞術(shù)檢測CD4+T細胞、CD8+T細胞中SLAMF7表達及CD4/CD8比例，F(xiàn)lowJo10.1軟件分析結(jié)果。每組樣本重復(fù)檢測3次。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血淋巴細胞中SLAMF7表達比較 病例組T-LGLL患者、對照組CD8+T細胞中SLAMF7陽性表達率分別為99.55%±0.16%、65.75%±9.00%，病例組T-LGLL患者CD8+T細胞中SLAMF7陽性表達率高于對照組(P<0.05)；病例組NK-LGLL患者、對照組NK細胞中SLAMF7陽性表達率分別為98.63%±0.32%、99.13%±0.59%，兩組相比，P>0.05。

2.2 兩組淋巴細胞形態(tài)特點及SLAMF7與嗜天青顆粒表達的關(guān)系 與正常淋巴細胞相比，大顆粒淋巴細胞體積變大、胞質(zhì)增多、細胞核大且不規(guī)則，其中可見多少不等的核仁，輕微嗜堿性胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不等的嗜天青大顆粒(圖1)。大顆粒淋巴細胞中SLAMF7陽性表達率為98.60%±0.50%、Granzyme B+Perforin陽性表達率為90.92%±0.90%，Pearson相關(guān)分析顯示，SLAMF7陽性表達與Granzyme B+Perforin陽性表達呈正相關(guān)(r=0.818，P<0.05)。

圖1 病例組大顆粒淋巴細胞形態(tài)(瑞氏-吉姆薩染色)

2.3 PHA刺激后CD4+T細胞、CD8+T細胞中SLAMF7表達及CD4/CD8比例變化 0.5 μg/mL的PHA刺激3 d后，CD4/CD8比例無明顯變化，0、24、48、72 h分別為1.356±0.01、1.407±0.03、1.290±0.02、1.270±0.02(P均>0.05)。0.5 μg/mL的PHA刺激0、24、48、72 h后CD4+T細胞中SLAMF7陽性表達率分別為29.40%±1.20%、52.70%±3.90%、79.40%±0.20%、51.80%±3.50%，CD8+T細胞中SLAMF7陽性表達率分別為49.93%±2.59%、72.47%±2.28%、98.73%±0.64%、99.17%±0.43%。CD4+T細胞中SLAMF7陽性表達率在PHA刺激24 h后上調(diào)，48 h時達峰值，72 h時有所降低(P均<0.05)；CD8+T細胞中SLAMF7陽性表達率從刺激24 h后逐漸升高，48 h達峰值，72 h仍維持高值(P均<0.05)；低濃度PHA持續(xù)刺激3 d后，CD8+T細胞中SLAMF7陽性表達率高于CD4+T細胞(P均<0.05)。

3 討論

2002年WHO將LGLL分為T-LGLL和NK-LGLL，2008年又根據(jù)臨床表現(xiàn)將后者分為侵襲性大顆粒淋巴細胞白血病(ANKL)和慢性NK細胞淋巴增殖性疾病(CLPD-NK)，并沿用至今[11,12]。T-LGLL作為最常見的LGLL(>75%)，臨床表現(xiàn)多為無癥狀或進展緩慢，中位生存期可達10年，但近年來不斷有侵襲性T-LGLL的病例報道，多與NK細胞相關(guān)抗原的表達有關(guān)(如CD56)。NK-LGLL相對罕見(<15%)，CLPD-NK(<10%)臨床表現(xiàn)與T-LGLL相似，二者治療方案多采取隨訪觀察，必要時予以對癥治療[13，14]。在實際臨床工作中，從形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分病理性的單克隆大顆粒淋巴細胞和生理反應(yīng)性的多克隆大顆粒淋巴細胞。LGLL的診斷需結(jié)合臨床表現(xiàn)、細胞形態(tài)學(xué)、免疫表型、分子遺傳學(xué)指標(biāo)，診斷過程復(fù)雜且費時，治療方案多參考少量的回顧性分析。因此，需要尋找新的免疫標(biāo)志物以協(xié)助該病的快速診斷及治療。

SLAMF7是免疫球蛋白超家族受體CD2家族的一員，能夠活化其胞內(nèi)基于免疫受體酪氨酸的開關(guān)基序(ITSMs)，招募EAT-2調(diào)節(jié)淋巴細胞的免疫功能[6]。對SLAMF7的研究主要集中在多發(fā)性骨髓瘤(MM)的治療方面，人源化的抗SLAMF7單克隆抗體Elotuzumab可通過直接激活NK細胞、增強抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)、阻斷可溶性SLAMF7(sSLAMF7)與MM細胞上SLAMF7間的相互作用這三種途徑清除腫瘤細胞[15，16]。但目前尚無關(guān)于SLAMF7和LGLL的研究。本研究發(fā)現(xiàn),SLAMF7在T-LGLL患者的CD3+CD8+大顆粒T細胞中明顯高表達；雖然在NK-LGLL大顆粒淋巴細胞中SLAMF7也呈強表達，但與正常NK細胞表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。大顆粒淋巴細胞的特征是胞質(zhì)中出現(xiàn)多少不等的嗜天青顆粒，其中最主要的成分包括Perforin和Granzyme B，而Perforin和Granzyme B主要存在于細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞中，是宿主細胞殺傷靶細胞的主要效應(yīng)分子[17]。在NK細胞中，SLAMF7活化后，通過一系列途徑導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增強、MAPK/ERK通路激活，最終導(dǎo)致NK細胞中顆粒極化、促進細胞毒顆粒向靶細胞釋放[18]，因此，推測SLAMF7可能參與大顆粒淋巴細胞中嗜天青顆粒的形成。我們對患者的血涂片進行瑞氏-吉姆薩染色，鏡檢顯示腫瘤細胞為胞質(zhì)中顆粒增多的大淋巴細胞；相關(guān)性分析表明，大顆粒淋巴細胞中SLAMF7陽性表達與Perforin+Granzyme B陽性表達呈正相關(guān)，間接表明SLAMF7與白血病細胞中的大顆粒有關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中Perforin+Granzyme B的表達僅限于SLAMF7+CD8+T細胞，且SLAMF7活化能夠增強CD8+T細胞的活性[19]，這進一步支持了我們的推測。

至今，LGLL的發(fā)病原因仍不清楚，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由未知抗原(細菌、病毒等)的慢性持續(xù)刺激導(dǎo)致淋巴細胞的異?；罨c單克隆增殖[14]。我們利用低濃度的PHA持續(xù)刺激PBMC來模擬淋巴細胞慢性活化，并觀察SLAMF7表達的變化。實驗結(jié)果顯示，在相同刺激條件下，CD8+T細胞中SLAMF7陽性表達增加明顯高于CD4+T細胞，且更穩(wěn)定，這與我們在T-LGLL患者中觀察到的SLAMF7在CD8+T細胞中高表達的現(xiàn)象相一致，由此推斷SLAMF7可作為CD8+T細胞持續(xù)活化的指標(biāo)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，SLAMF7在LGLL大顆粒淋巴細胞中高表達，并與細胞中嗜天青大顆粒主要成分Perforin和Granzyme B的表達水平呈正相關(guān)，提示SLAMF7是細胞毒性淋巴細胞的特征標(biāo)志，有望成為LGLL潛在的診斷指標(biāo)及治療靶點。由于LGLL發(fā)病率低，本研究樣本量不足，在接下來的研究中，我們將擴大樣本量進一步探討SLAMF7在LGLL發(fā)生、發(fā)展中的作用。有研究表明SLAMF7能夠誘導(dǎo)同樣缺乏EAT-2的MM細胞的中樞生長和生存信號通路[20]，推測SLAMF7本身參與了LGLL白血病性細胞的顆粒形成、凋亡或腫瘤細胞間同型黏附激活的生存通路的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果為LGLL新的診斷標(biāo)志物或免疫治療靶點的探索提供了理論依據(jù)。