張曉玉 張亞玲 靳學(xué)慧 閆天雨 趙 澤

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)/黑龍江省植物抗性研究中心，163319，黑龍江大慶）

稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae，無性態(tài)為Pyricularia oryzae）引起的嚴(yán)重侵染性病害，是全世界水稻產(chǎn)區(qū)的重要病害之一[1]。20世紀(jì)90年代以來，稻瘟病在我國各稻區(qū)大面積持續(xù)流行，發(fā)病面積年均超過4 000萬hm2，造成的損失高達(dá)10億kg[2]。目前，防治稻瘟病最普遍、最有效的措施就是種植抗病品種，因此，深入研究水稻與稻瘟病之間相互作用關(guān)系十分重要。

自1971年Hebert[3]首次報(bào)道馬唐瘟菌于培養(yǎng)基上對(duì)峙培養(yǎng)，成功誘發(fā)形成有性世代，1979年Kato等[4]首次證明，在實(shí)驗(yàn)室條件下，稻瘟病菌株可發(fā)生有性生殖，從而使有關(guān)稻瘟病菌有性態(tài)的研究工作大量開展。雖然稻瘟病菌是否在自然界中發(fā)生有性生殖沒有準(zhǔn)確結(jié)論[5]，但研究稻瘟病菌有性生殖后代與水稻品種的相互作用關(guān)系是定位和克隆無毒基因的重要手段。迄今為止，稻瘟病菌中已經(jīng)鑒定出40多個(gè)無毒基因，但僅 有PWL1[6]、PWL2[7]、PWL3[6]、PWL4[6]、Avr1-CO39[8]、Avr-Pita[9]、ACE1[10]、Avr-Pia[11]、Avr-Pii[12]、Avr-Pik/km/kp[12]、AvrPiz-t[13]、Avr-Pi9[14]、Avr-Pib[15]、Avr-Pita1[16]等14個(gè)無毒基因被克隆。近年來，也有不少研究學(xué)者對(duì)稻瘟病菌雜交組合產(chǎn)生有性后代進(jìn)行無毒性/毒性及親本菌株無毒基因組成情況分析。劉俊峰等[17]利用育性較好的稻瘟病菌進(jìn)行交配，分析其雜交后代對(duì)水稻品種梅雨明致病性的分離情況，研究表明親本菌株對(duì)水稻品種梅雨明的無毒性是由1個(gè)基因控制；Ma等[18]利用121個(gè)SSR標(biāo)記在稻瘟病菌株CHL346和CHL42的雜交后代中定位了無毒基因APi15；王艷麗等[19]利用無毒性/毒性與SSR、SCAR和RAPD等分子標(biāo)記結(jié)合構(gòu)建稻瘟病菌的遺傳圖譜，將無 毒 基 因Avr2-K59、AvrC105TTP1、AvrZh156、AvrXuan1641、AvrXuan6392、Avr103TTP定 位 在第1、第4和第7染色體上。

目前，仍有大量無毒基因未被準(zhǔn)確定位及克隆。本研究利用國際稻瘟病菌標(biāo)準(zhǔn)交配型菌株KA3及黑龍江省育性較好的稻瘟病菌株HLJ6122雜交產(chǎn)生的后代群體對(duì)已知抗性基因品種致病性分離結(jié)果，分析親本菌株無毒基因的組成情況，為相應(yīng)無毒基因的遺傳圖譜構(gòu)建及克隆提供分析材料。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為國際稻瘟病菌標(biāo)準(zhǔn)交配型菌株KA3（交配型MAT1-1）和黑龍江省稻瘟病菌株HLJ6122（交配型MAT1-2）及其64個(gè)雜交后代單孢菌株。KA3菌株由福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院王宗華教授和王寶華副教授提供，HLJ6122菌株分離自黑龍江省水稻種植區(qū)的發(fā)病植株。

1.2 供試水稻品種

已知抗性的IRBL系列水稻品種：IRBLa-A（Pi-a）、IRBLi-F5（Pi-i）、IRBLk-Ka（Pi-k）、IRBLkp-K60（Pi-kp）、IRBLz-Fu（Pi-z）、IRBLzt-T（Pi-zt）、IRBLta-K1（Pi-ta）、IRBLb-B（Pi-b）、IRBL7-W（Pi-7t）、IRBL12-M（Pi-12t）、IRBL19-M（Pi-19t）、IRBLkm-Ts（Pi-km）、IRBL20-IR24（Pi-20）、IRBLta2-Pi（Pi-ta2），以麗江新團(tuán)黑谷為感病對(duì)照。試驗(yàn)材料均由黑龍江省植物抗性研究中心提供。

1.3 稻瘟病菌的交配及子囊孢子的分離

試驗(yàn)于2019年進(jìn)行。稻瘟病菌交配及子囊孢子分離的具體方法參見王寶華[20]的方法。將2個(gè)親本菌株HLJ6122和KA3在燕麥培養(yǎng)基上對(duì)峙培養(yǎng)。將菌株先在28℃恒溫培養(yǎng)，待菌落邊緣相遇，轉(zhuǎn)移到20℃條件下光照培養(yǎng)15～20d，直至菌株間產(chǎn)生明顯而成熟的子囊殼。

在子囊殼完全成熟后，用接種針挑單個(gè)子囊殼置于裝有滅菌水的載玻片中；蓋上蓋玻片，輕輕擠壓以釋放子囊孢子；移走蓋玻片，用適量無菌水將子囊孢子洗入已制備好的水瓊脂培養(yǎng)基平板上，用滅菌的三角玻璃棒涂布于平板表面上。于培養(yǎng)箱中28℃恒溫培養(yǎng)，24h后檢查子囊孢子的萌發(fā)情況，將萌發(fā)的單個(gè)子囊孢子挑取到PDA培養(yǎng)基上，繼續(xù)于28℃培養(yǎng)。

1.4 育苗與接種

采用室內(nèi)水培法進(jìn)行水稻育苗。挑選飽滿的種子，用1.25‰的多菌靈溶液浸種24h后，于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，播種于固定在塑料水培盒內(nèi)的定植籃中，每個(gè)定植籃播種10粒，待苗長至3葉1心期后，采用噴霧法接種，即將含有0.01%的吐溫20的孢子懸浮液均勻噴灑到水稻葉片上，接菌后在28℃黑暗培養(yǎng)24h，繼續(xù)保濕培養(yǎng)5d[21-22]。接種后7～10d，按照稻瘟病病情調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)記載發(fā)病情況。根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，0～3級(jí)為抗?。ˋ），4～9級(jí)為感?。╒）。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌HLJ6122與KA3毒性差異分析

將2個(gè)親本菌株HLJ6122和KA3接種在14個(gè)水稻品種上，作為對(duì)照的麗江新團(tuán)黑谷在所有的接種試驗(yàn)中均為感病，表明接種條件適宜。親本菌株HLJ6122除對(duì)IRBLk-Ka、IRBLz-Fu、IRBLb-B、IRBL19-M共4個(gè)水稻品種無毒外，對(duì)其他供試水稻品種均有毒，親本菌株KA3只對(duì)IRBLkp-K60水稻品種有毒，對(duì)其他水稻品種均無毒，結(jié)果見表1。親本菌株HLJ6122和KA3只在IRBLk-Ka、IRBLkp-K60、IRBLz-Fu、IRBLb-B、IRBL19-M共5個(gè)水稻品種上毒性類型一致，其中，親本菌株HLJ6122和KA3對(duì) IRBLk-Ka、IRBLz-Fu、IRBLb-B、IRBL19-M共4個(gè)水稻品種表現(xiàn)為無毒性，對(duì)IRBLkp-K60品種均表現(xiàn)為毒性。由此可見，稻瘟病菌HLJ6122和KA3之間存在較大的毒性差異，對(duì)二者交配產(chǎn)生的有性后代進(jìn)行致病性遺傳分析有著重要意義。

2.2 親本菌株致病性的遺傳分析

2個(gè)親本菌株HLJ6122和KA3雜交產(chǎn)生的64個(gè)子囊孢子對(duì)各供試水稻品種的毒性分離比例情況見表1。2個(gè)親本菌株對(duì)不同的供試水稻品種毒性不同，表明供試菌株作用在不同水稻品種上具有不同的遺傳背景，在14個(gè)供試水稻品種中，親本菌株 HLJ6122對(duì) IRBLa-A、IRBLi-F5、IRBLkp-K60、IRBLzt-T、IRBLta-K1、IRBL7-W、IRBL12-M、IRBLkm-Ts、IRBL20-IR24、IRBLta2-Pi共 10個(gè)水稻品種產(chǎn)生毒性，而KA3對(duì)其均無毒性，其中雜交后代菌株對(duì)IRBLi-F5、IRBLta-K1、IRBL12-M、IRBLta2-Pi共4個(gè)水稻品種的無毒性/毒性分離比分別為 35∶29、37∶27、30∶33、25∶39，卡平方測驗(yàn)χ2＜3.84，差異不顯著，結(jié)果符合1∶1的期望值，據(jù)此推斷親本菌株KA3對(duì)以上水稻品種的非致病性均受單個(gè)基因控制；對(duì)IRBLa-A、IRBLzt-T、IRBL7-W、IRBLkm-Ts、IRBL20-IR24共5個(gè)水稻品種雜交后代產(chǎn)生的無毒性/毒性分離比分別為41∶23、38∶21、21∶41、12∶51、21∶43，卡平方測驗(yàn)均χ2＜3.84，差異不顯著，結(jié)果符合1∶3或3∶1的期望值，表明親本菌株KA3對(duì)這些水稻品種的非致病性受2個(gè)基因控制。

表1 KA3與HLJ6122及其64個(gè)雜交后代菌株在單基因系水稻品種上的毒性差異Table 1 Segregation of virulence between KA3 and HLJ6122 and their 64 progeny isolates on single-gene rice varieties

親本菌株HLJ6122和KA3對(duì)IRBLkp-K60品種均表現(xiàn)為有毒，后代群體中出現(xiàn)9個(gè)對(duì)其無毒的個(gè)體，55個(gè)對(duì)其有毒的個(gè)體，卡平方測驗(yàn)χ2＜3.84，差異不顯著，結(jié)果符合1∶3的期望值，推測出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因是由于無毒基因在親本菌株中的表達(dá)受到抑制；2個(gè)親本菌株對(duì)IRBLk-Ka、IRBLz-Fu、IRBLb-B、IRBL19-M水稻品種均表現(xiàn)為無毒，其后代菌株卻出現(xiàn)有毒個(gè)體，對(duì)水稻品種的無毒性/毒性比分別為 53∶10、55∶9、57∶7、52∶12，卡平方測驗(yàn)χ2＜3.84，差異不顯著，結(jié)果也符合1∶3的期望值，因此對(duì)稻瘟病菌無毒基因遺傳分析還需進(jìn)行深入研究。

2.3 稻瘟病菌雜交后代對(duì)供試水稻品種的無毒性/毒性分析

將2個(gè)親本菌株HLJ6122和KA3雜交產(chǎn)生的64個(gè)子囊孢子后代接種在14個(gè)水稻品種上，出現(xiàn)了明顯的毒性分離，共出現(xiàn)53種毒性類型，其中毒性類型A1由4個(gè)菌株組成，與親本菌株HLJ6122毒性類型一致；毒性類型A2～A6分別由4、3、2、2、2個(gè)菌株組成（表2）。其他47個(gè)毒性類型均由單個(gè)菌株組成，沒有與親本菌株KA3相同的毒性類型。

表2 稻瘟病菌HLJ6122與KA3雜交后代在14個(gè)水稻品種的毒性分離Table 2 Virulence separation of sexual progeny from the cross Magnaporthe oryzae HLJ6122 and KA3 on 14 rice varieties

2個(gè)親本菌株對(duì)IRBLk-Ka、IRBLz-Fu、IRBLb-B、IRBL19-M共4個(gè)水稻品種毒性類型一致，均表現(xiàn)為無毒。在這4個(gè)水稻品種中，其后代菌株共出現(xiàn)12種毒性類型（表3），其中毒性類型B1由43個(gè)菌株組成，與2個(gè)親本菌株毒性一致，均表現(xiàn)為無毒；毒性類型B3由3個(gè)菌株組成，對(duì)以上4個(gè)品種均表現(xiàn)為有毒；毒性類型B2、B4、B5分別由6、3、2個(gè)菌株組成；剩余7個(gè)毒性類型均有1個(gè)菌株構(gòu)成。

表3 稻瘟病菌HLJ6122與KA3雜交后代在4個(gè)水稻品種的毒性分離Table 3 Virulence separation of sexual progeny from the cross Magnaporthe oryzae HLJ6122 and KA3 on 4 rice varieties

對(duì)于IRBLa-A、IRBLi-F5、IRBLzt-T、IRBLta-K1、IRBL7-W、IRBL12-M、IRBLkm-Ts、IRBL20-IR24、IRBLta2-Pi水稻品種，親本菌株HLJ6122均表現(xiàn)為有毒，KA3均表現(xiàn)為無毒，其雜交后代出現(xiàn)44種毒性類型（表4），其中有12個(gè)菌株與親本菌株HLJ6122毒性一致，均表現(xiàn)為有毒，組成毒性類型C1；毒性類型C2、C3、C4、C5、C6、C7分別包含5、2、2、2、2、2個(gè)菌株；剩余37個(gè)毒性類型均僅有1個(gè)菌株，沒有與親本菌株KA3毒性一致的菌株。2個(gè)親本菌株對(duì)水稻品種IRBLkp-K60均有毒，其雜交后代中有9個(gè)菌株對(duì)該水稻品種沒有毒性，其他55個(gè)菌株均有毒性。

表4 稻瘟病菌HLJ6122與KA3雜交后代在9個(gè)水稻品種的毒性分離Table 4 Virulence separation of sexual progeny from the cross Magnaporthe oryzae HLJ6122 and KA3 on 9 rice varieties

3 討論

水稻與稻瘟病菌之間的相互作用符合經(jīng)典“基因?qū)颉奔僬f，在水稻中每個(gè)顯性的抗性基因，在稻瘟病菌中就會(huì)有與之相對(duì)應(yīng)的顯性無毒基因[23]，水稻只有存在相應(yīng)的抗病基因，而稻瘟病菌中又存在相對(duì)應(yīng)的無毒基因，才能表現(xiàn)出抗病。早在20世紀(jì)20年代，日本學(xué)者首次報(bào)道了稻瘟病菌對(duì)水稻品種的致病性存在差異，利用其雜交后代的遺傳學(xué)分析證明水稻與稻瘟病互作關(guān)系符合孟德爾遺傳規(guī)律[24]。

本試驗(yàn)將HLJ6122與KA3菌株的雜交后代對(duì)已知抗性基因的14個(gè)IRBL基因系列水稻品種進(jìn)行接種試驗(yàn)。結(jié)果表明，稻瘟病菌對(duì)多數(shù)水稻品種的無毒性/毒性分離符合孟德爾遺傳規(guī)律，表現(xiàn)為1∶1、1∶3、3∶1、15∶1 分離比例，同時(shí)表明控制病原菌對(duì)不同水稻品種無毒性/毒性的基因數(shù)量不同。菌株KA3分別對(duì)水稻品種IRBLi-F5、IRBLta-K1、IRBL12-M、IRBLta2-Pi持有1個(gè)基因，對(duì)品種IRBLa-A、IRBLzt-T、IRBL7-W、IRBLkm-Ts、IRBL20-IR24持有2個(gè)基因。陸凡等[25]、李進(jìn)斌等[26]、王艷麗等[27]研究也表明親本菌株的有性后代對(duì)不同水稻品種無毒性/毒性比例是由基因數(shù)量調(diào)控的。

然而，對(duì)病菌的非致病基因是否為顯性表達(dá)，仍未有明確定論[28]。大多數(shù)研究學(xué)者認(rèn)為病菌的非致病基因是顯性表達(dá)，而有研究表明稻瘟病菌的無毒基因是否為顯性表達(dá)還有待研究[25，29]。Lau等[30]對(duì)親本菌株雜交產(chǎn)生的有性后代進(jìn)行遺傳分析，表明親本菌株中存在無毒基因的抑制子基因。病菌的無毒基因在表達(dá)的過程中存在抑制子基因，親本菌株對(duì)IRBLkp-K60品種均表現(xiàn)為有毒，后代菌株中卻出現(xiàn)無毒個(gè)體，推測可能因?yàn)橛H本菌株之一存在無毒基因的抑制子基因，導(dǎo)致無毒基因失去表達(dá)功能，或者由于基因發(fā)生突變，使后代個(gè)體表現(xiàn)無毒[31-32]。本研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)，2個(gè)親本菌株 HLJ6122和 KA3對(duì) IRBLk-Ka、IRBLz-Fu、IRBL19-M、IRBLb-B共4個(gè)水稻品種均表現(xiàn)為無毒，其后代菌株卻出現(xiàn)有毒個(gè)體，有毒個(gè)體分別為10、9、7、12個(gè)。也有相似的研究結(jié)果，如王寶華[20]、王艷麗等[27]對(duì)雜交后代群體進(jìn)行遺傳分析時(shí)，2個(gè)親本菌株對(duì)品種表現(xiàn)無毒，而后代菌株出現(xiàn)毒性分離，分析可能原因是2個(gè)親本菌株均含有1個(gè)非等位的無毒基因，在有性過程中，染色體發(fā)生變異，導(dǎo)致后代的無毒基因失去表達(dá)功能，從而表現(xiàn)為有毒性。

利用已知抗性基因的水稻品種對(duì)稻瘟病菌無毒基因進(jìn)行遺傳分析是推定、分析和比較無毒基因的有效手段，是無毒基因物理圖譜構(gòu)建及克隆的前提條件。但稻瘟病菌無毒基因與水稻的抗性基因相互作用機(jī)制復(fù)雜，因此探究稻瘟病菌對(duì)水稻品種無毒性/毒性遺傳規(guī)律還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

采用14個(gè)單基因系水稻品種對(duì)稻瘟病菌親本菌株HLJ6122和KA3進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明共出現(xiàn)53種毒性類型，無毒性/毒性比分別表現(xiàn)為1∶1、1∶3、3∶1、15∶1。結(jié)果證明稻瘟病菌雜交后代菌株對(duì)水稻品種產(chǎn)生毒性類型較為復(fù)雜，并符合孟德爾遺傳規(guī)律。