盧美琳 ，石嘉琛，王家敏，喬自林

（1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

隨著肥胖和肥胖相關(guān)疾病的普遍，脂肪細(xì)胞增殖和分化機(jī)制引起人們的重視，脂肪前體細(xì)胞在經(jīng)歷細(xì)胞形態(tài)學(xué)和一系列相關(guān)基因表達(dá)變化后分化為成熟脂肪細(xì)胞，三?；视偷暮铣稍黾?，脂質(zhì)積累[1]。PA是一種16碳長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸，分子式為C16H32O2，在肥胖患者中血液濃度會(huì)升高[2]。其是棕櫚油中飽和脂肪酸的主要成分[3]，在細(xì)胞中，該脂肪酸被轉(zhuǎn)化為磷脂，二?；视秃蜕窠?jīng)酰胺。Ahmed B S[4]等研究表明100 uM對(duì)牛衛(wèi)星細(xì)胞增殖是促進(jìn)作用，而200 uM是抑制其增殖；因此，在體外培養(yǎng)綿羊前體脂肪細(xì)胞時(shí)添加不同濃度PA，檢測(cè)其對(duì)綿羊前體脂肪細(xì)胞增殖的影響，為研究能量對(duì)肥胖機(jī)制提供基礎(chǔ)理論。

1 材料

1.1 主要材料試劑

小尾寒羊前體脂肪細(xì)胞，從健康的雌性1日齡小尾寒羊尾部脂肪組織采集經(jīng)培養(yǎng)后液氮中保存，保存的細(xì)胞代次為P3代。

DMEM/F12培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶(蘭州百靈生物，批號(hào):20190409和20140425)；胎牛血清（FBS）(蘭州民海生物，批號(hào)：20141002)；青霉素、鏈霉素、棕櫚酸（純度 ＞98%）均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)為3111）、酶標(biāo)儀（型號(hào)為MK3），均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（型號(hào)為IC1000），購(gòu)自Countstar公司；倒置生物顯微鏡（型號(hào)為CKX-41），購(gòu)自O(shè)lympus公司。

2 方法

2.1 復(fù)蘇前體脂肪細(xì)胞

從液氮罐中取出凍存的小尾寒羊前體脂肪細(xì)胞，按照常規(guī)方法復(fù)蘇細(xì)胞，顯微鏡下觀察待細(xì)胞基本貼壁后，換新鮮完全培養(yǎng)基，降低DMSO對(duì)細(xì)胞的損傷，細(xì)胞匯合致密單層后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 PA對(duì)前體脂肪細(xì)胞增殖的影響

待前體脂肪細(xì)胞匯合致密單層后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變成透亮的圓形時(shí)，加入10 ml完全培養(yǎng)基終止消化，吹打制細(xì)胞懸液，取樣計(jì)數(shù)。以1×104個(gè)/ml的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放置37℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄掉原培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中分別添加濃度為100、150、200、250、300和350 μmol/L的PA，空白對(duì)照組只添加等量的完全培養(yǎng)基，而陰性對(duì)照組添加終濃度為 0.01%無(wú)水乙醇，培養(yǎng)1、3、5、7和9 d后，用MTT法[5]檢測(cè)各孔的吸光度值。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)蘇培養(yǎng)

前體脂肪細(xì)胞復(fù)蘇活率為93%，4 h后貼壁（圖1A），待細(xì)胞基本貼壁后，換新的完全培養(yǎng)基，細(xì)胞成長(zhǎng)梭型，細(xì)胞增殖加快，72 h后細(xì)胞匯合成單層致密（圖1B）。

圖1 小尾寒羊前體脂肪細(xì)胞形態(tài)

圖2 PA對(duì)小尾寒羊前體脂肪細(xì)胞增殖的影響

3.2 PA對(duì)前體脂肪細(xì)胞增殖的影響

由圖2可知，PA作用于前體脂肪細(xì)胞1 d后，濃度為150 μmol/L可促進(jìn)細(xì)胞增殖，且與對(duì)照組相比差異極顯著。作用時(shí)間延長(zhǎng)至3～9 d后，濃度為100 μmol/L和150 μmol/L均可促進(jìn)細(xì)胞增殖；濃度在200～350 μmol/L均抑制細(xì)胞增殖，且各組之間抑制作用差異極顯著。

4 討論

PA的生物學(xué)特性和藥理學(xué)活性較廣泛，有研究表明PA與代謝綜合征、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥等具有相關(guān)性[6-7]；周瑤瑤[8]等研究表明隨著PA濃度的升高抑制Hela細(xì)胞增殖更明顯；周光[8]等研究表明0.2 mmol/L PA作用于肝細(xì)胞24 h細(xì)胞活力降低約50%。該試驗(yàn)用100、150、200、250、300和350 μmol/L的PA培養(yǎng)綿羊前體脂肪細(xì)胞，結(jié)果作用1 d后，濃度為150 μmol/L促進(jìn)細(xì)胞增殖；作用時(shí)間延長(zhǎng)至3～9 d時(shí)，100 μmol/L和150 μmol/L均可促進(jìn)細(xì)胞增殖，200～350 μmol/L反而抑制細(xì)胞增殖。