黃 強，陳智成，練志全，鄧 銘，蔡丹鳳，侯云飛，楊健華，李耀坤

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

MAPK信號通路中，Ras/Raf/Mek（絲裂原活化蛋白激酶/Erk激酶）/Erk（細胞外信號調(diào)節(jié)激酶）途徑是控制細胞增殖、分化和存活的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的核心[1-3]，主要起正調(diào)控作用；Erk的激活對細胞增殖至關(guān)重要[4]；Ras蛋白是Mek/Erk通路的激活因子，不僅能促進脂肪細胞的分化[5]，也能促進成骨基因表達和成骨細胞增殖[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，山羊背最長肌組織的mRNA組學(xué)特性，在不同發(fā)育階段，呈現(xiàn)明顯的時序表達特征[7]。山羊至少有三個肌發(fā)生波，在胎兒發(fā)育的中后期（85 d左右）肌細胞明顯增加[8]。動物骨骼肌形成和發(fā)育機制一直是研究的熱點，關(guān)于動物肌肉生長和發(fā)育的基因調(diào)控已有很多報道，但大部分是檢測單個基因的在動物組織的表達情況[9]，關(guān)于調(diào)控山羊肌肉生長發(fā)育的通路基因報道較少。

本次研究通過分析MAPK信號通路中Ras/Raf/Mek通路基因在雷州山羊不同生長發(fā)育時期背最長肌的表達情況，探究影響雷州山羊背最長肌生長發(fā)育的關(guān)鍵基因。實驗檢測了雷州山羊胎兒期90 d、100 d、120 d及出生后3月齡、6月齡的雷州山羊背最長肌的Ras/Raf/Mek通路基因表達水平，為進一步研究雷州山羊肌肉生長發(fā)育機制提供理論參考依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

雷州山羊妊娠第90 d、100 d、120 d胎兒各3只，及出生后3月齡、6月齡雷州山羊各2只，由溫氏羊業(yè)有限公司提供。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒（型號為Total RNA Kit II R6934），購自O(shè)MEGA公司。

1.3 主要儀器

超凈工作臺（型號為SW-CJ-1B），購自中國蘇凈集團；高速冷凍離心機（型號為MicroCL 17R），微量核酸蛋白質(zhì)測定儀（型號為Nano-200），實時熒光定量PCR儀（型號為QuantStudio 7 Flex System），均購自賽默飛世爾科技公司。

2 方法

2.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

采用OMEGA Total RNA Kit II R6934試劑盒對動物組織總RNA進行抽提，RNA用ND2000超微量核酸蛋白質(zhì)測定儀檢測抽提得到的RNA的OD值和濃度，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性及是否存在DNA和蛋白質(zhì)的污染。

去DNA反應(yīng)體系：5×DNA Eraser Buffer 2μl，gDNA 1 μl，Total RNA 7 μl。加完后混勻、離心、PCR儀按設(shè)置好的程序運行。

反轉(zhuǎn)錄體系為：去DNA反應(yīng)液 10 μl，Prime ScriPt RT Enzyme MixⅠμl，RTPrimer mix 1 μl，5×Primer ScriPt Buffer 4 μl，RNA-free H2O 4 μl。加完后混勻離心，PCR儀按設(shè)置好的程序運行。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA放置-20 ℃冰箱保存。

2.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank (httP://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的候選基因序列，以及通過查詢資料和引用其他文獻資料，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計獲得下列引物，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物信息見表1。

2.3 實時熒光定量PCR

本實驗采用SYBRGreen染料法進行熒光定量PCR反應(yīng)。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為：上、下游引物各0.3μl，2×SYBRGreen熒光染料5μl，cDNA模板1 μl，加ddH2O補至總體積10 μl；熒光定量PCR的擴增程序為：45個循環(huán)（95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火10 s，72℃延伸15 s）；58℃檢測熒光值；15℃保存。

表1 熒光定量Q-PCR所用引物的相關(guān)信息

2.4 統(tǒng)計分析

本實驗采用2-ΔΔCt法計算各個基因的mRNA相對表達量，以β-Actin為內(nèi)參基因進行標準化校準。所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件One-way ANOVA進行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因的組織表達譜

采用qRT-PCR技術(shù)，以β-actin作為內(nèi)參，以腎組織為參照，結(jié)果表明（圖1）Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在8個組織中均有表達。Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在背最長肌和心臟中的表達量最高，在下丘腦、肝、脾、肺和垂體中的表達量較低。

圖1 Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因的組織表達譜分析

3.2 不同生長發(fā)育時期Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在背最長肌的表達情況

Ras基因在胎兒發(fā)育120 d齡時的表達量最高，表達模式為：120 d＞100 d＞90 d＞6月齡＞3月齡，120 d齡胎兒背最長肌中的基因表達量顯著高于6月齡羔羊。Raf基因在羔羊3月齡的表達量最高，3月齡羔羊的表達量顯著高于90 d和100 d胎兒。RafA基因在胎兒發(fā)育120 d齡時的表達量達到最高，90 d齡的表達量最低，在出生后6月齡的表達量高于3月齡，但各組間基因的表達量差異不顯著。Mek1基因在120 d的表達量顯著高于其它組，其余組間基因的表達量差異不顯著。Mek2基因在胎兒期120 d的時候基因的表達量最高，120 d的表達量顯著高于100 d；90 d、100 d、3月齡和6月齡的基因表達量沒有顯著差異（圖2）。

圖2 Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在背最長肌的表達情況

3.3 不同生長發(fā)育時期Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在心臟的表達變化規(guī)律

Ras基因在羔羊3月齡時的表達量最高，在胎兒期100 d的表達量最低，表達模式為：3月齡＞90 d＞6月齡＞90 d＞100 d，3月齡羔羊心臟中的基因表達量顯著高于其它組。Raf基因在羔羊3月齡的表達量最高，100 d齡的表達量最低，3月齡羔羊的表達量顯著高于其它組。表達模式為：3月齡＞6月齡＞120 d＞90 d＞100 d。RafA基因在羔羊3月齡時表達量最高，3月齡基因的表達量顯著高于其它組。Mek1基因在胎兒期120 d的表達量顯著高于其它組，3月齡和6月齡羔羊表達量顯著高于胎兒期90 d和100 d。Mek2基因在羔羊3月齡時基因的表達量最高，3月齡的基因表達量顯著高于其它組，90 d、100 d、120 d和6月齡的基因表達量沒有顯著差異（圖3）。

圖3 Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因在心臟的表達情況

4 討論

雷州山羊是我國著名的地方優(yōu)良品種，也是廣東省唯一的肉用羊地方良種。雷州山羊具有瘦肉多、脂肪少、膻味輕、營養(yǎng)豐富、味美多汁、易消化吸收等特點，深受消費者青睞[10]，其市場需求量巨大，市場前景十分廣闊，具有較大開發(fā)潛力。但近年來，雷州山羊品種退化十分嚴重，產(chǎn)肉性能在逐年下降[11]，針對優(yōu)質(zhì)山羊品種存在的生長不穩(wěn)定、生長速度慢等問題，本研究通過分析MAPK信號通路中相關(guān)基因在雷州山羊各個生長發(fā)育時期的表達規(guī)律，為雷州山羊背最長肌的生長發(fā)育的分子機理的闡明提供證據(jù)，同時也為肉羊生長發(fā)育機制提供科學(xué)依據(jù)。MAPK信號通路中的Ras/Raf/Mek/Erk細胞信號傳遞通路是由一個GTP結(jié)合蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)，其活化的中心是使Ras進行鳥苷酸交換變成其活化形式Ras-GTP[12]。該通路可由活性氧、Ca2+、蛋白激酶C等激活，參與體內(nèi)的多種生理生化功能，對細胞生長、分化、增殖、發(fā)育、凋亡均有影響[13]。Ras的表達對Raf有促進作用，其機理為Ras-GTP直接與Raf結(jié)合，形成一個臨時的膜錨定信號。而活化的Raf再通過磷酸化促進分裂原激活蛋白激酶的激酶（Mek）環(huán)上的絲氨酸殘基而將其激活[14]。Mek/Erk通路參與了胰島素調(diào)控骨骼肌成肌細胞增殖，具有促增殖或抗凋亡作用，是多途徑多通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[15]，抑制此通路，可以抑制平滑肌的增殖[16]，也可以抑制骨骼的細胞增殖、成熟和鈣沉積[17]。小鼠敲除Raf基因?qū)嶒灡砻?，Raf基因在各組織生成中均具有一定功能[18]，尤其對胎兒生長發(fā)育發(fā)揮關(guān)鍵作用。基于上述原因，如果能確定Ras/Raf/Mek信號通路基因在雷州山羊背最長肌表達量的差異和表達規(guī)律，就可采用基因敲除、轉(zhuǎn)基因、注射抗體、反義核酸等技術(shù)，控制其表達量，從而使其背最長肌充分發(fā)育，提高動物的生長性能。另一方面，通過有關(guān)基因表達量與生長發(fā)育規(guī)律相聯(lián)系，有助于掌握雷州山羊生長發(fā)育特點，以便在妊娠母羊胎兒生長發(fā)育關(guān)鍵時期和正常的生長發(fā)育時期合理調(diào)控外界環(huán)境和營養(yǎng)條件，充分挖掘其生長潛能。

雷州山羊的組織表達譜分析結(jié)果顯示，Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因均在雷州山羊的背最長肌有較高的表達量，說明其對調(diào)控肌肉生長發(fā)育有重要作用。在心臟組織中，3月齡羔羊的Ras、Raf、RafA和Mek2基因表達量顯著高于其他組，Mek1在胎兒期120 d表達量顯著高于其他組。小鼠心臟發(fā)育開始于胚胎發(fā)育期的第7.5天，在胚胎第11.5天之后心肌細胞大量增殖，促心生長因子有Hedgehog、骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPSs)、成纖維生長因子（firbroblast groth factors, FGFs）和非經(jīng)典Wnt/JNK通路[19]，但關(guān)于山羊心臟發(fā)育過程中的分子調(diào)控研究報道較少，本文可為雷州山羊心臟生長發(fā)育機制提供一定的理論參考。在所研究的雷州山羊胎兒期的三個生長階段，Ras、Raf、RafA、Mek1和Mek2基因均在120 d表達量最高；表達模式為：120 d＞100 d＞90 d。120 d Mek1基因mRNA的表達量顯著高于100 d、90 d的基因表達量山羊妊娠周期為150 d，其胎兒生長發(fā)育后期（60 d以后）增長的體重占初生重90%，在妊娠后期胎兒的生長發(fā)育速度越來越快。本研究結(jié)果表明，Ras/Raf/Mek信號通路基因在雷州山羊的背最長肌發(fā)育中呈相同的表達模式，此通路對細胞的生長、增殖發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[20]。根據(jù)實驗結(jié)果推測，雷州山羊在胎兒生長發(fā)育120 d的時候有一個肌肉發(fā)生波。綜合判斷，Ras/Raf/Mek信號通路在雷州山羊胎兒生長發(fā)育后期起關(guān)鍵作用，并且起正調(diào)控作用，但具體機制尚不明確。通過分析3月齡、6月齡相關(guān)基因表達情況，并未發(fā)現(xiàn)較明顯的基因表達模式，可能該通路基因在出生后的調(diào)控機制發(fā)生了變化，具體的調(diào)控機制仍有待深入分析。