呂新林，徐國兵*，許雷鳴，洪穩(wěn)穩(wěn)

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032；2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051)

前胡為傘形科植物白花前胡PeucedanumpraeruptorumDunn的干燥根[1]。其主要成分為吡喃香豆素類，其中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量較高。藥理研究發(fā)現(xiàn)，該類成分不僅有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和保肝等作用，還能增進(jìn)胰島素分泌，減輕Ⅱ型糖尿病并發(fā)癥對(duì)機(jī)體的損害[2-6]。國內(nèi)學(xué)者對(duì)前胡香豆素類成分提取工藝已經(jīng)進(jìn)行了較詳細(xì)研究，提取方式多采用有機(jī)溶劑浸提法和回流法，香豆素類成分提取率較低[7]。本課題組通過SFE法制備出9批前胡總香豆素提取物，進(jìn)行定性定量研究，初步建立了前胡總香豆素提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器和試劑

HA220-50-06超臨界萃取裝置(南通華安超臨界萃取有限公司)；薄層色譜半自動(dòng)點(diǎn)樣器Linomat-5、薄層色譜攝像儀Repeostar3(GAMAG公司)；XS204電子天平和XS105電子天平(Mettler-Toledo公司)；Agilent 1200 和Agilent 1260(安捷倫科技有限公司)；TU-1901紫外分光光度計(jì)(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品白花前胡甲素(批號(hào)111711-201703)和白花前胡乙素(批號(hào)111904-201804)購于中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純(Fisher 公司)；水為高純水，余下試劑為分析純。9批前胡飲片，按照2015版《中國藥典》(一部)[1]前胡飲片標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行全項(xiàng)檢驗(yàn)，結(jié)果均符合規(guī)定，樣品信息見表1。

表1 前胡飲片樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 SFE法制備前胡總香豆素

取適量前胡藥材粗粉，在萃取溫度60 ℃、萃取壓力30 MPa、夾帶劑95%乙醇比例15%和CO2體積流量20 g/min條件下萃取1.5 h[8]。提取物4 ℃靜置冷藏，待結(jié)晶析出完全后移出上層脂肪油。加適量石油醚(30～60 ℃)，充分混勻后離心，棄上清，反復(fù)上述操作至石油醚(30～60 ℃)呈無色，沉淀置通風(fēng)櫥內(nèi)揮干，即得前胡總香豆素提取物。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取適量白花前胡甲素和白花前胡乙素標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇配制成每1 mL含白花前胡甲素100.24 μg和白花前胡乙素68.48 μg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液

精密稱取13.36 mg前胡總香豆素提取物置于25 mL容量瓶，加甲醇適量，超聲使其溶解，甲醇定容至刻度，搖勻。精密吸取2.0 mL置于5 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 TLC鑒別

吸取5 μL上述對(duì)照品及各批次供試品溶液，自動(dòng)點(diǎn)樣器點(diǎn)于同一板上，石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶1)為展開劑展開，置紫外光燈(366 nm)下驗(yàn)視。結(jié)果，在與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)的位置上，各供試品顯現(xiàn)出相同顏色的熒光斑點(diǎn)并分離良好，見圖1。

注:1、9為白花前胡甲素;2～5、7、10～13為供試品;6、14為白花前胡乙素;8為白花前胡甲素和白花前胡乙素混合標(biāo)準(zhǔn)品圖1 前胡總香豆素提取物薄層鑒別

2.4 檢查

2.4.1 水分

取各批次供試品2～5 g，參照水分測定法(2015版《中國藥典》[1]四部通則0832第二法)測定，測得各批次前胡總香豆素提取物水分含量為0.16%～0.17%。

2.4.2 熾灼殘?jiān)?/p>

取各批次供試品1～2 g，參照熾灼殘?jiān)?2015版《中國藥典》[1]四部通則0841)進(jìn)行測定，測得前胡總香豆素?zé)胱茪堅(jiān)繛?.10%～0.11%。

2.4.3 重金屬

取各批次供試品1 g，參照重金屬檢查法(2015版《中國藥典》[1]四部通則0821第二法)進(jìn)行檢測。結(jié)果，供試品溶液顏色均未超過標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液，各批次前胡總香豆素重金屬含量均小于20 mg/kg。

2.4.4 砷鹽

取各批次供試品5 g，參照2015版《中國藥典》(一部)[1]連翹提取物項(xiàng)下砷鹽檢測法進(jìn)行檢測。結(jié)果，供試品砷斑顏色均未超過標(biāo)準(zhǔn)砷斑，各批次前胡總香豆素砷鹽含量均小于2 mg/kg。

2.5 特征圖譜

2.5.1 特征圖譜的建立

取供試品溶液，按“2.7.1”色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰信息，結(jié)果見圖2。將各批次前胡總香豆素提取物色譜峰信息導(dǎo)入中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2012A)，以QH-01為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，該9批前胡總香豆素提取物特征圖譜相似度大于0. 98，表明各批前胡總香豆素提取物之間具有良好的一致性，生成的對(duì)照特征圖譜見圖3。

圖2 前胡總香豆素提取物的HPLC圖

圖3 前胡總香豆素提取物特征圖譜

2.5.2 特征峰的標(biāo)定

根據(jù)9批前胡總香豆素提取物特征圖譜結(jié)果，共標(biāo)定5個(gè)特征峰，經(jīng)參比標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰可知，峰3為白花前胡甲素，峰5為白花前胡乙素。

2.6 前胡總香豆素的含量測定

2.6.1 方法學(xué)考察

2.6.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取對(duì)照品溶液，以甲醇為參比溶劑，在321 nm處測定吸光度。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)吸光度為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，白花前胡甲素回歸方程為Y=0.0195X+0.229 9(r=0.999 5)；白花前胡乙素回歸方程為Y=0.018 6X+0.216 3(r=0.999 0)，表明白花前胡甲素和白花前胡乙素在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.1.2 重復(fù)性、精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批前胡總香豆素提取物粉末適量，按“2.2.2”方法配制供試品溶液6份，以甲醇為參比溶劑，在321 nm處測定吸光度；取其中一份樣品，在321 nm處，連續(xù)6次測定吸光度；另取一份樣品分別于0、2、4、8、12、24 h在321 nm處測定吸光度并計(jì)算RSD。結(jié)果，RSD均小于2%，表明該方法重復(fù)性、儀器精密度和24 h樣品穩(wěn)定性良好。

2.6.1.3 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取前胡總香豆素提取物粉末平行6份，分別加入一定濃度的對(duì)照品溶液，按“2.2.2”方法配制供試品溶液，以甲醇為參比溶劑，在321 nm處測定吸光度并計(jì)算前胡總香豆素的加樣回收率以及RSD。結(jié)果前胡總香豆素類成分加樣回收率為97.21%，RSD小于2%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.6.2 樣品測定

按“2.2.2”方法制備各批供試品溶液，以甲醇為參比溶劑，在321 nm處測定吸光度，帶入“2.6.1.1”回歸方程求得前胡總香豆素的含量。結(jié)果，9批樣品前胡總香豆素含量分別以白花前胡甲素和白花前胡乙素計(jì)依次為78.69%～90.07%和85.62%～98.10%。

2.7 白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量測定

2.7.1 色譜條件

Inertial ODS-SPCl8色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇-乙腈-水(34∶32∶34)；檢測波長321 nm；流速1.0 mL/min；柱溫為室溫；進(jìn)樣量10 μL。

2.7.2 專屬性試驗(yàn)

分別吸取對(duì)照品和供試品溶液，在“2.7.1”色譜條件下測定色譜峰，結(jié)果見圖4。由圖可知，供試品HPLC圖中白花前胡甲素和白花前胡乙素相應(yīng)色譜峰位置上無干擾，表明該方法專屬性強(qiáng)。

注:a.對(duì)照品溶液色譜峰;b.供試品溶液色譜峰;1.白花前胡甲素;2.白花前胡乙素圖4 專屬性考察HPLC圖

2.7.3 線性范圍

吸取“2.2.1”對(duì)照品溶液，在“2.7.1”色譜條件下測定峰面積。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程以及線性范圍。結(jié)果，白花前胡甲素和白花前胡乙素在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

表2 白花前胡甲素和白花前胡乙素的線性范圍

2.7.4 重復(fù)性、精密度穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批前胡總香豆素提取物粉末適量，按“2.2.2”方法制備供試品溶液6份，在“2.7.1”色譜條件下測定峰面積；取其中一份溶液，在“2.7.1”色譜條件下連續(xù)測定峰面積6次；另取一份供試品溶液分別于0、2、4、8、12和24 h在“2.7.1”色譜條件下測定峰面積。結(jié)果，測得白花前胡甲素和白花前胡乙素峰面積RSD均小于2%，表明該方法重復(fù)性、儀器精密度和24 h樣品穩(wěn)定性良好。

2.7.5 加樣回收試驗(yàn)

取前胡總香豆素提取物粉末適量，平行6份，分別加入一定濃度的對(duì)照品溶液，按“2.2.2”方法配制供試品溶液，“2.7.1”色譜條件下測定峰面積，計(jì)算回收率，測得各白花前胡甲素和白花前胡乙素回收率依次為99.68%和99.66%，RSD均小于2%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.7.6 耐用性試驗(yàn)

2.7.6.1 不同儀器和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

取同一份對(duì)照品溶液，采用Inertial ODS-SP C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，在“2.7.1”色譜條件下測定峰面積，比較Agilent 1260，Agilent 1200，Shimadzu 20A三種不同高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)白花前胡甲素和白花前胡乙素相對(duì)校正因子的影響；另在 Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)上，比較Inertial ODS-SP(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent (150 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent (250 mm×4.6 mm，5 μm)和CAPCELLPAK(250 mm×4.6 mm，5 μm)不同型號(hào)規(guī)格C18色譜柱對(duì)白花前胡甲素和白花前胡乙素相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果，相對(duì)校正因子RSD均小于2%，表明不同儀器和色譜柱對(duì)白花前胡甲素和白花前胡乙素相對(duì)校正因子無顯著影響。

2.7.6.2 不同柱溫、流速和波長對(duì)相對(duì)校正因子的影響

取同一份對(duì)照品溶液，在“2.7.1”色譜條件下測定峰面積，在 Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)上，考察不同柱溫(25，30，40℃)，流速(0.6，0.8，1.0 mL/min)和波長(318，321，324 nm)對(duì)白花前胡甲素和白花前胡乙素相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果，相對(duì)校正因子RSD均小于2%，表明不同柱溫、流速和波長對(duì)白花前胡甲素和白花前胡乙素相對(duì)校正因子無顯著影響。

2.7.7 樣品測定

取各批次樣品配制的供試品溶液，在“2.7.1”色譜條件下測定峰面積，帶入回歸方程求得含量。結(jié)果，9批前胡總香豆素提取物中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量分別為602.42～721.44 mg/g和38.34～101.46 mg/g。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器，在190～900 nm波長下分別對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長掃描，在318～324 nm波長范圍內(nèi)，兩種溶液有最大吸收峰，故采用321 nm作為測定波長[9]。

3.2 SFE技術(shù)提取前胡香豆素優(yōu)勢(shì)明顯

SFE技術(shù)是近年來一項(xiàng)中藥提取新技術(shù)，具有低溫、高效、無溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)。通過工藝參數(shù)優(yōu)化，SFE提取前胡香豆素類成分的效率更高[8-11]，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

3.3 總香豆素提取物與飲片中前胡甲素和前胡乙素含量呈正相關(guān)

試驗(yàn)選取的9批前胡飲片，按照《中國藥典》2015年版一部[1]前胡飲片標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格，白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量分別為10.01～17.76 mg/g和3.02～6.31 mg/g，各批次含量差異較明顯。前胡SFE提取物中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量，與各批次飲片中相應(yīng)成分含量呈正相關(guān)。