畢亞玲，戴玲玲，谷 剛，李君君

(1.安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100； 2.安徽科技學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

日本看麥娘(Alopecurusjaponicus)是冬小麥田主要的惡性雜草之一[1]，生產(chǎn)上主要使用精噁唑禾草靈和甲基二磺隆來(lái)防治日本看麥娘[2-3]。近年來(lái)，由于長(zhǎng)期單一地使用精噁唑禾草靈，多個(gè)地區(qū)小麥田日本看麥娘對(duì)其產(chǎn)生較高的抗藥性。甲基二磺隆對(duì)部分抗乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑類除草劑的日本看麥娘具有較好的防除效果[4]，但近年來(lái)已有日本看麥娘等禾本科雜草對(duì)其產(chǎn)生抗性的報(bào)道[5-7]。雜草的抗藥性主要是由靶標(biāo)和非靶標(biāo)2個(gè)方面的因素產(chǎn)生[8-9]。靶標(biāo)抗性主要是指植株體內(nèi)除草劑作用靶標(biāo)的某個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變導(dǎo)致的抗藥性[10]。王凌越[11]研究發(fā)現(xiàn)，6種氨基酸突變會(huì)導(dǎo)致日本看麥娘對(duì)精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗藥性，并對(duì)相同作用機(jī)理的其他ACCase抑制劑產(chǎn)生抗性。非靶標(biāo)抗性主要是指雜草通過(guò)提高體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和細(xì)胞色素P450氧化酶等代謝酶的活性，導(dǎo)致到達(dá)靶標(biāo)位點(diǎn)的藥劑減少，從而形成抗性[12-15]。韓瑞娟等[16]、裴濤[17]研究發(fā)現(xiàn)，GSTs活性增強(qiáng)可導(dǎo)致日本看麥娘對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性。

目前安徽、江蘇、河南等省稻茬麥田日本看麥娘對(duì)精噁唑禾草靈和甲基二磺隆的敏感性明顯下降，主要表現(xiàn)為田間施用劑量明顯上升，但防治效果不好[7，18]。為從源頭上了解抗性發(fā)生的原因，建立針對(duì)性的抗性雜草治理策略，延緩雜草抗藥性的發(fā)展，本試驗(yàn)擬擴(kuò)增和比對(duì)ACCase和乙酰乳酸合成酶(ALS)基因在日本看麥娘抗性、敏感種群的序列差異，明確靶標(biāo)抗性機(jī)理；通過(guò)測(cè)定比較日本看麥娘敏感種群與抗性種群中GSTs活性，探究日本看麥娘抗性種群的非靶標(biāo)抗性機(jī)理；研究日本看麥娘抗性種群對(duì)多種ACCase和ALS抑制劑的交互抗性，評(píng)價(jià)其對(duì)不同除草劑的敏感性，為抗性日本看麥娘的綜合治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試雜草種子：抗性種群AFT采自安徽省六安市壽縣安豐塘鎮(zhèn)約有12 a精噁唑禾草靈和7 a甲基二磺隆用藥歷史的冬小麥田。敏感種群AH-7為本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道的日本看麥娘敏感種群[19]，采自安徽省滁州市鳳陽(yáng)縣非麥田。試驗(yàn)前期使用整株水平測(cè)定法[20]測(cè)定抗性種群AFT對(duì)精噁唑禾草靈和甲基二磺隆的抗性倍數(shù)，分別為44.33和34.43。

試劑：Tris-HCl，上海試劑公司；十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na)，無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；二硫蘇糖醇(DTT)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、聚乙烯比咯烷酮(PVP-40)，上海麥克林生化科技有限公司；還原型谷胱甘肽(GSH)，湖北弘景化工有限公司；2，4-二硝基氯苯(CDNB)，上海浩然生物技術(shù)有限公司。

試驗(yàn)所用除草劑：60 g·L-1精噁唑禾草靈(fenoxaprop-P-ethyl)水乳劑，浙江天豐生物科學(xué)有限公司；30 g·L-1甲基二磺隆(mesosulfuron-methyl)可分散油懸浮劑，浙江天一生物科技有限公司；15%炔草酯(clodinafop-propargyl)可濕性粉劑，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；86.5%烯草酮(clethodim)原藥，山東濱農(nóng)科技有限公司；5%唑啉草酯(pinoxaden)乳油，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；70%氟唑磺隆水分散粒劑，浙江天一生物科技有限公司；240 g·L-1甲咪唑煙酸(imazapic)水劑，美豐農(nóng)化有限公司；100 g·L-1雙草醚(bispyribac-sodium)懸浮劑，浙江天豐生物科學(xué)有限公司。

儀器：生化培養(yǎng)箱SHP-250，上海坤肯生物化工有限公司；HCL-2000行走式噴霧塔，昆山恒創(chuàng)力科技有限公司；ABI 2720 PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司；H1650R高速冷凍離心機(jī)，上海翼悾機(jī)電有限公司；JY600E電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)

選取種子健康狀況、成熟度、飽滿度等相對(duì)一致的日本看麥娘種子，75%乙醇清洗后無(wú)菌水漂洗3次，均勻撒在培養(yǎng)皿中無(wú)菌水潤(rùn)濕的濾紙上，置于19 ℃生化培養(yǎng)箱中催芽。種子露白后，將其播種到裝有壤土的直徑為12 cm的塑料花盆中，每盆均勻播種15粒。然后置于溫室內(nèi)培養(yǎng)[20 ℃～25 ℃/10 ℃～15 ℃，12 h/12 h(L/D)]，相對(duì)濕度65%～75%，自然光照強(qiáng)度。于一葉一心期間苗，每盆留10株株高相近、生長(zhǎng)狀況良好的幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 日本看麥娘種群ACCase和ALS基因克隆

日本看麥娘的質(zhì)體ACCase和ALS基因片段沒(méi)有內(nèi)含子，故直接以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。將日本看麥娘培養(yǎng)至三葉一心期，剪取抗性、敏感種群植株的幼嫩葉片，-80 ℃保存。采用SDS法提取DNA[21]。根據(jù)NCBI中GenBank登記的日本看麥娘Alopecurusjaponicus質(zhì)體型ACCase基因序列(JQ068820.1)和ALS基因序列(AJ437300)分別設(shè)計(jì)ACCase和ALS基因的擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物如表1所示。凝膠電泳鑒定后將PCR產(chǎn)物送往公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性測(cè)定

日本看麥娘三葉一心期時(shí)，使用HCL-2000行走式噴霧塔分別進(jìn)行精噁唑禾草靈(有效成分含量62.1 g·hm-2)、甲基二磺隆(有效成分含量9.0 g·hm-2)莖葉噴霧處理，噴霧量450 L·hm-2。藥劑用蒸餾水配制成母液，以噴施等量清水作為對(duì)照處理，每處理4次重復(fù)。施藥后繼續(xù)置于溫室內(nèi)培養(yǎng)，藥后第0、1、3、5、7和12天剪取植株地上部分，置于-80 ℃冰箱保存。

表1 擴(kuò)增日本看麥娘質(zhì)體型ACCase和ALS基因引物

Table 1 Primers used to amplifyACCaseandALSgene ofA.japonicus

引物Primers序列Sequence(5′-3′)擴(kuò)增長(zhǎng)度Length/bp退火溫度Annealingtemperature/℃ACC-FTTTCCCAGCGGCAGACAGAT143755.0ACC-RTCCCTGGAGTCTTGCTTTCAALS-FTCACCAACCACCTTTTCCG165956.0ALS-RCACATTGCACCTTTAGGTCT

GSTs粗酶液提?。喝≈仓杲M織0.5 g，在液氮中研磨成粉，加入Tris-Hcl緩沖液，參照文獻(xiàn)[16]的方法提取GSTs粗酶液。

GSTs活性測(cè)定：根據(jù)吳進(jìn)才等[22]的方法，在3 mL 0.1 mol·L-1Tris-Hcl緩沖液中加入0.1 mol粗酶液，25 ℃條件下保溫10 min，加入13 mmol·L-1的2，4-二硝基氯苯(CDNB)，反應(yīng)10 min，測(cè)量340 nm處的吸光度D值。以未加粗酶液的處理為對(duì)照，檢測(cè)數(shù)據(jù)為處理的D值減去對(duì)照的D值。按照如下公式計(jì)算GSTs活性。

GSTs活性(nmol·min-1·mg-1)=D×1000/(c×9.5)。

式中：D為吸光度，c為粗酶液的蛋白質(zhì)濃度(mg·mL-1)。GSTs相對(duì)活性為施藥組GSTs活性與同日空白對(duì)照組GSTs活性的比值。

1.2.4 AFT種群對(duì)不同除草劑的交互抗性測(cè)定

測(cè)定種群AFT和AH-7對(duì)炔草酯、烯草酮、唑啉草酯、甲咪唑煙酸、氟唑磺隆、雙草醚的敏感性和抗性倍數(shù)。日本看麥娘培養(yǎng)至三葉一心期，使用HCL-2000行走式噴霧塔分別進(jìn)行除草劑噴霧處理，施藥方法參照1.2.3節(jié)，除草劑使用劑量見(jiàn)表2，以等量蒸餾水處理為空白對(duì)照，各處理3次重復(fù)。施藥后21 d剪取日本看麥娘植株地上部分，于80 ℃烘箱中烘干至質(zhì)量不再發(fā)生變化，稱干質(zhì)量，計(jì)算干質(zhì)量抑制率。以劑量對(duì)數(shù)值(x)和干質(zhì)量抑制率(y)建立回歸方程，分別計(jì)算各除草劑對(duì)抗性種群和敏感種群的有效中量GR50，計(jì)算AFT種群對(duì)不同除草劑的抗性倍數(shù)。

干質(zhì)量抑制率(%)=[(對(duì)照雜草干質(zhì)量-處理雜草干質(zhì)量)/對(duì)照雜草干質(zhì)量]×100；

2 結(jié)果與分析

2.1 AFT種群中ACCase和ALS的基因突變

表2 除草劑的有效成分用量

Table 2 Active ingredients doses used for determining the sensitivity ofAlopecurusjaponicusto different herbicides g·hm-2

處理Treatments炔草酯Clodinafop-propargylAFTAH-7烯草酮ClethodimAFTAH-7唑啉草酯PinoxadenAFTAH-7甲咪唑煙酸ImazapicAFTAH-7氟唑磺隆Flucarbazone-NaAFTAH-7雙草醚Bispyribac-sodiumAFTAH-7處理145.001.8072.002.8845.001.8024.008.0031.501.9510.003.00Treatment 1處理2225.009.00360.0014.40225.009.0072.0024.00126.007.8030.0010.00Treatment 2處理31125.0045.001800.0072.00900.0045.00360.0072.00504.0031.50150.0030.00Treatment 3

在種群AFT和AH-7中擴(kuò)增ACCase基因的CT區(qū)，將測(cè)序結(jié)果與大穗看麥娘(Alopecurusmyosuroides)的ACCase基因序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果(表3、表4)表明，敏感種群AH-7的ACCase基因CT區(qū)2027位氨基酸為色氨酸(TGG)，抗性種群AFT的該位置為半胱氨酸(TGC)；敏感種群AH-7在ALS基因的574位氨基酸為色氨酸(TGG)，抗性種群AFT在該位置為精氨酸(CGG)。

2.2 精噁唑禾草靈、甲基二磺隆對(duì)日本看麥娘GSTs活性的影響

圖1-A顯示，精噁唑禾草靈藥劑處理1 d，抗性種群AFT的GSTs活性開(kāi)始增強(qiáng)，處理3～7 d GSTs活性增加較快，并在第7天達(dá)到最高，表明此時(shí)抗性植株體內(nèi)的代謝反應(yīng)水平被精噁唑禾草靈誘導(dǎo)至最高。處理12 d抗性植株GSTs活性下降，可能是由于植株體內(nèi)對(duì)精噁唑禾草靈的代謝趨于完成，代謝反應(yīng)水平開(kāi)始恢復(fù)為正常水平。敏感種群AH-7在藥后第1～5 d GSTs活性變化平緩，藥后5～7 d GSTs活性增強(qiáng)，隨后又開(kāi)始減弱，可能是受到藥劑影響或者外界環(huán)境脅迫引起的應(yīng)激反應(yīng)。

表3 日本看麥娘抗性種群質(zhì)體型ACCase第2027位的氨基酸突變序列分析

Table 3 Sequence alignment and derived amino acids around position 2027 of the plastidicACCasegene from resistantA.japonicuspopulation

種群Population各氨基酸的位置和堿基及相應(yīng)的氨基酸序列Amino acid position, relative sequence of nucleotide and derived amino acid2021202220232024202520262027202820292030大穗看麥娘CTGTTCATACTTGCTAACTGGAGAGGCTTCAlopecurus myosuroidesLeuPheIleLeuAlaAsnTrpArgGlyPheAH-7(S)CTGTTCATACTTGCTAACTGGAGAGGCTTCLeuPheIleLeuAlaAsnTrpArgGlyPheAFT(R)CTGTTCATACTTGCTAACTGCAGAGGCTTCLeuPheIleLeuAlaAsnCysArgGlyPhe

氨基酸位數(shù)以大穗看麥娘的質(zhì)體型ACCase全長(zhǎng)序列為標(biāo)準(zhǔn)。

Amino acid positions correspond to the full-length plastidicACCaseinA.myosuroides.

表4 日本看麥娘抗性種群ALS第574位氨基酸突變序列分析

Table 4 Sequence alignment and derived amino acids around position 574 of theALSgene from resistantA.japonicuspopulation

種群Population各氨基酸的位置和堿基及相應(yīng)的氨基酸序列The amino acid position, relative sequence of nucleotide and derived amino acid573574575576577578579580581582擬南芥Arabidopsis thalianaCAATGGGAAGATCGGTTCTACAAAGCTAACGlnTrpGluAspArgPheTyrLysAlaAsnAH-7 (S)CAGTGGGAGGACAGGTTTTACAAGGCCAATGlnTrpGluAspArgPheTyrLysAlaAsnAFT (R)CAGCGGGAGGACAGGTTTTACAAGGCCAATGlnArgGluAspArgPheTyrLysAlaAsn

氨基酸位數(shù)以模式植物擬南芥的ALS全長(zhǎng)序列為標(biāo)準(zhǔn)。

Amino acid positions correspond to the full-lengthALSinArabidopsisthaliana.

圖1-B顯示：甲基二磺隆藥劑處理后1～3 d抗性種群AFT的GSTs活性緩慢增強(qiáng)，說(shuō)明抗性植株體內(nèi)代謝反應(yīng)水平開(kāi)始被誘導(dǎo)升高；藥后3～7 d GSTs活性增加較快，并在第7 d達(dá)到最大，表明在此時(shí)植株體內(nèi)的代謝反應(yīng)水平被甲基二磺隆誘導(dǎo)至最高；藥后7～12 d，抗性種群AFT的GSTs活性開(kāi)始減弱，可能是由于植株體內(nèi)對(duì)甲基二磺隆的代謝趨于完成，代謝反應(yīng)水平恢復(fù)至正常水平。甲基二磺隆藥劑處理后1～3 d敏感種群AH-7的GSTs活性變化緩慢，藥后3 d GSTs活性開(kāi)始減弱，隨后又有增強(qiáng)，在第7天達(dá)到最強(qiáng)，12 d又下降。這可能是由于藥劑或者外界環(huán)境脅迫引起的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致GSTs活性出現(xiàn)波動(dòng)，具體原因還需要進(jìn)一步的研究。

綜合來(lái)看，經(jīng)精噁唑禾草靈和甲基二磺隆藥劑處理后，日本看麥娘抗性種群AFT的GSTs活性高于敏感種群AH-7，說(shuō)明與敏感種群相比，抗性種群體的GSTs對(duì)精噁唑禾草靈和甲基二磺隆的代謝能力增強(qiáng)。

2.3 AFT種群對(duì)不同除草劑的交互抗性

表5結(jié)果顯示，AFT種群對(duì)炔草酯、烯草酮和氟唑磺隆的抗性倍數(shù)分別為27.90、34.43、10.30，表現(xiàn)出高水平的抗性；對(duì)唑啉草酯、甲咪唑煙酸、雙草醚的抗性倍數(shù)分別為5.49、6.42、5.01，表現(xiàn)為中等水平抗性。

同一種群無(wú)相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。 Data marked without the same lowercase letter of the same populations indicated significant differences at P<0.05.圖1 精噁唑禾草靈(A)和甲基二磺隆(B)對(duì)日本看麥娘種群GSTs相對(duì)活性的影響Fig.1 Effect of fenoxaprop-P-ethyl (A) and mesosulfuron-methyl (B) on relative GSTs activity of Alopecurus japonicas

表5 AFT種群對(duì)不同除草劑的交互抗性

Table 5 Cross-resistance in resistant and susceptibleAlopecurusjaponicuspopulations to different herbicides

藥劑Herbicide種群Population回歸方程Regression equationr有效中量GR5095%的置信區(qū)間95% confidence limit抗性倍數(shù)Resistance ratio炔草酯AFTy=3.2273+0.7097x0.9674310.28291.97～328.5927.90clodinafop-propargylAH-7y=3.6916+1.2568x0.990011.1210.76～11.481.00烯草酮AFTy=1.8733+1.1165x0.9993637.30595.12～679.4834.43clethodimAH-7y=2.9131+1.6581x0.997918.5117.19～19.831.00唑啉草酯AFTy=2.2586+1.5057x0.994966.4860.11～72.855.49pinoxadenAH-7y=3.4952+1.3662x0.959612.1111.80～12.421.00甲咪唑煙酸AFTy=1.6393+1.4826x0.9739184.06173.14～194.986.42imazapicAH-7y=2.3813+1.8020x0.974928.6526.24～31.061.00氟唑磺隆AFTy=1.8331+1.5898x0.986198.1788.47～107.8710.30flucarbazone-NaAH-7y=3.5739+1.4546x0.98519.538.56～10.501.00雙草醚AFTy=1.8561+1.5380x0.9980110.69100.58～120.805.01bispyribac-sodiumAH-7y=3.4924+1.1222x0.956522.1020.48～23.721.00

3 討論

目前研究表明，雜草的抗藥性主要與靶標(biāo)酶基因突變有關(guān)。Guo等[23]報(bào)道，在多抗性看麥娘中同時(shí)檢測(cè)到了ACCase基因Ile-1781-Leu和ALS基因Trp-574-Leu 2種突變。本研究使用的抗性日本看麥娘種群AFT采自安徽省六安市壽縣安豐塘鎮(zhèn)，其對(duì)精噁唑禾草靈、甲基二磺隆的抗性均較高，屬于多抗性種群。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，多抗性日本看麥娘種群AFT的靶標(biāo)酶基因中同時(shí)發(fā)現(xiàn)ACCase基因CT區(qū)基因和ALS基因2種突變類型，這可能是導(dǎo)致種群AFT對(duì)二者產(chǎn)生抗性的重要原因。前人研究表明，氨基酸位點(diǎn)突變可能會(huì)引起雜草對(duì)同一種作用機(jī)制的不同除草劑產(chǎn)生交互抗性[24-25]。本試驗(yàn)中抗性種群AFT對(duì)其他除草劑產(chǎn)生了不同水平的交互抗性，對(duì)炔草酯、烯草酮、氟唑磺隆均產(chǎn)生了較高水平的抗性，對(duì)唑啉草酯、甲咪唑煙酸、雙草醚產(chǎn)生了中等水平抗性。

非靶標(biāo)抗性也是導(dǎo)致雜草產(chǎn)生抗性的重要原因[26]。有報(bào)道證實(shí)了部分雜草的抗藥性源自植株內(nèi)細(xì)胞色素P450氧化酶系和GSTs活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致對(duì)除草劑的代謝增強(qiáng)[17，27-28]。精噁唑禾草靈和甲基二磺隆處理前，AH-7和AFT種群的GSTs活性差異不明顯；藥后7 d，抗性種群AFT的GSTs活性顯著強(qiáng)于敏感種群AH-7，說(shuō)明經(jīng)除草劑誘導(dǎo)后抗性日本看麥娘種群基于GSTs代謝酶介導(dǎo)的代謝反應(yīng)水平升高，加快了雜草植株對(duì)除草劑的代謝解毒反應(yīng)，推測(cè)抗性種群AFT的多抗性可能與植株體內(nèi)GSTs代謝酶介導(dǎo)的代謝反應(yīng)機(jī)制有關(guān)。本試驗(yàn)只測(cè)定了GSTs活性，對(duì)于非靶標(biāo)抗性方面還需要進(jìn)行更深入的研究，比如測(cè)定P450氧化酶活性對(duì)種群AFT敏感性的影響等。

日本看麥娘種群抗藥性的發(fā)生除了與自身的生物學(xué)特性有關(guān)外，與發(fā)生地不合理的用藥習(xí)慣和種植制度也有很大關(guān)系。日本看麥娘種群的靶標(biāo)抗性和非靶標(biāo)抗性，以及對(duì)不同種類除草劑交互抗性的研究，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中選用不同作用機(jī)理的藥劑，減小雜草抗藥性的發(fā)生具有指導(dǎo)意義。農(nóng)業(yè)管理部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)種植戶的農(nóng)技培訓(xùn)，科學(xué)合理使用農(nóng)藥，避免出現(xiàn)單一藥劑連續(xù)使用的情況，同時(shí)需要加強(qiáng)對(duì)不同作用機(jī)理藥劑的開(kāi)發(fā)與推廣。