汪?日燕，劉海培，孫傳強，韓文念，賈明正，蔣學慧

液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜定量分析算法

汪?日燕1，劉海培1，孫傳強1，韓文念2，賈明正2，蔣學慧1

(1. 天津大學精密儀器與光電子工程學院，天津 300072；2. 天津國科醫(yī)工科技發(fā)展有限公司，天津 300399)

基于自主研制的三重四極桿質(zhì)譜儀，設(shè)計開發(fā)整套譜圖信息提取分析方法，包括原始數(shù)據(jù)去噪、色譜解析與識別、譜峰匹配、曲線擬合等算法．設(shè)計一種依賴曲線信號與噪聲自身數(shù)據(jù)特點的算法對原始譜圖噪聲進行自動去除，采用平滑Z-score法與多段斜率法相結(jié)合的算法對目標化合物質(zhì)量色譜峰進行解析，實現(xiàn)對復雜基質(zhì)樣品中拖尾峰、肩峰和低濃度峰的準確識別，對待測譜峰進行保留時間校正，并對曲線擬合權(quán)重進行討論，最終建立標準曲線進行定量分析．以人體血清中25-羥基維生素D檢測實驗為例，采用自開發(fā)算法，完成了一套液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式下的配套定量分析算法包．計算結(jié)果表明，選取1/2權(quán)重進行線性擬合，維生素D2和維生素D3的檢出限分別為1.1mg/L、1.5mg/L，定量下限分別為3.7mg/L、5.1mg/L，線性相關(guān)系數(shù)達0.998以上．連續(xù)6d對高低兩個濃度的維生素D2和維生素D3質(zhì)控品測量其變異系數(shù)(CV值)在7%以內(nèi)，滿足日間精密度要求，實驗結(jié)果驗證了該分析算法的準確性．對人體血清中脂溶性維生素A和維生素E以及血漿中甲氧基腎上腺素(MN)和甲氧基去甲腎上腺素(NMN)兩個臨床應(yīng)用的數(shù)據(jù)結(jié)果進行定量分析，進一步驗證算法的可行性及普適性．本算法具有自適應(yīng)性，減少了優(yōu)化時間，提高了譜圖數(shù)據(jù)處理自動化水平，可為臨床相關(guān)疾病檢測診斷提供工具．

液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)；譜峰識別算法；定量分析；維生素D

三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)是一種典型的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，由串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)可獲得化合物豐富的碎片信息，其中多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)作為常用定量檢測方法，具有特異性強、靈敏度高、線性范圍廣等優(yōu)點[1]．液相色譜是以液體作為流動相，通過選取不同流動相和色譜柱達到良好的分離效果[2]．液相色譜與三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用可對復雜基質(zhì)樣本中的目標化合物進行分離，隨后實現(xiàn)高精確度和高靈敏度的實時檢測定量分析[3-4]，滿足臨床分析領(lǐng)域需求．

液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)用于定量分析檢測需獲取待測樣品質(zhì)量色譜峰及峰面積信息，然而在對臨床樣本檢測時，色譜柱流失物或復雜樣本基質(zhì)等產(chǎn)生的離子對待測化合物譜圖產(chǎn)生干擾，導致譜峰形狀不規(guī)則從而增加了識別分析難度[5]，影響分析結(jié)果的準確度．針對濃度信息提取分析方面的數(shù)據(jù)處理技術(shù)，近年來國內(nèi)外的專家學者提出了多種色譜峰識別的方法，常見的譜圖檢測方法主要有幅值法、一階導數(shù)法、二階導數(shù)法以及在此基礎(chǔ)上衍生的各種類似方法[6]．祝玉芳[7]采用譜峰多點上升下降變化趨勢的斜率來識別特征位置，解決了由于譜圖隨機性出現(xiàn)肩峰的問題，但是容易在一個譜峰中獲得多個特征點，影響峰面積計算結(jié)果．張磊等[8]對峰識別算法進行改進，使用一、二階導數(shù)法識別特征位置，但由于一階導數(shù)不易判斷肩峰出現(xiàn)情況，造成二階導數(shù)受干擾．斯坦福大學的Dromey等[9]提出了“峰型比較”的退卷積算法，該算法對色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)中每個質(zhì)荷比的質(zhì)量色譜圖進行分析，提取各個質(zhì)量色譜峰，在對應(yīng)的掃描時間選擇1～2個模型峰，然后將其他的質(zhì)量色譜峰與模型峰進行比較，以確定該碎片離子是否屬于某一化合物，處理完成后將相同峰形的碎片離子組合成為一個化合物的質(zhì)譜圖，從而完成退卷積的過程，但該方法比較適合于幾乎完全重疊的色譜峰的識別，并且算法參數(shù)選擇較為復雜．

本研究提出一種快速譜圖提取分析方法，開發(fā)形成原始數(shù)據(jù)去噪、譜圖解析識別、譜峰匹配、峰面積計算以及曲線擬合幾個功能模塊算法，從而獲得待測樣準確定量分析結(jié)果．基于自主研制的三重四極桿質(zhì)譜儀開發(fā)形成MRM掃描模式下的專用成套數(shù)據(jù)處理算法包，以人體血清中維生素檢測應(yīng)用為例，通過自開發(fā)譜峰識別與峰形校正算法，解決了色譜圖中肩峰、拖尾峰準確識別與匹配問題，節(jié)省色譜條件優(yōu)化時間，簡化液質(zhì)聯(lián)用前處理過程，形成了一種專用的快速智能譜圖解析方法包，便于譜圖信息提取的定量分析研究．

1?理論研究

1.1?信號與噪聲自動判別

樣品經(jīng)過LC-MS/MS檢測，需對得到的原始數(shù)據(jù)進行信號與噪聲判據(jù)．傳統(tǒng)區(qū)分信號與噪聲采用設(shè)定閾值法，依賴操作者人為干預，需要多次嘗試[10].為節(jié)省譜圖提取分析的過程，本研究設(shè)計一種依賴曲線信號與噪聲自身數(shù)據(jù)特點的算法，有利于對譜圖譜峰尤其是低濃度譜峰的起點、終點進行識別與判斷，其方程為

1.2?特征提取與計算

1.2.1?基于Z-score算法的譜峰區(qū)域判定

由于色譜條件及待測樣本身等性質(zhì)，色譜峰成非高斯對稱而具有拖尾或肩峰存在，影響譜峰識別的準確性進而影響定量結(jié)果．本文將Z-score模型用于譜峰區(qū)域判定，即根據(jù)當前數(shù)據(jù)點與距離某一移動窗口內(nèi)數(shù)據(jù)平均值加給定個標準偏差大小的值進行比較，基于均值與偏差的平滑加窗原理，能夠?qū)ψV峰個數(shù)尤其對于低強度峰進行準確識別，判斷譜峰起點、終點的位置．通過平滑Z-score算法構(gòu)造單獨的移動平均值和偏差，使得數(shù)據(jù)先前信號無論如何變化，后續(xù)信號均能以大致相同的精度識別出來．設(shè)定滑動移動窗口大小為lag，上下浮動閾值為threshold，計算得到移動窗均值avgFilter以及移動窗方差stdFilter．根據(jù)特定窗口大小對實驗采集的每組原始數(shù)據(jù)分別進行特征識別，構(gòu)造單獨移動的均值和標準差對數(shù)據(jù)進行標準化，對于測得的原始數(shù)據(jù)序列1、2至X進行變換得

當強度高于設(shè)定波動范圍時，定義signals＝1，即超出并高于取值范圍的離群數(shù)據(jù)，認為是峰出現(xiàn)區(qū)域；當強度低于設(shè)定波動范圍內(nèi)時，定義sig-nals＝-1，即超出但低于取值范圍的離群數(shù)據(jù)，不是峰出現(xiàn)區(qū)域；當強度在所設(shè)定波動范圍內(nèi)時，定義signals＝0，即在所取范圍內(nèi)，波動平緩沒有峰出現(xiàn)．

1.2.2?基于多段斜率法的特征點判定

多段斜率法是通過對相鄰幾個連續(xù)點的運動趨勢判斷特征點出現(xiàn)位置，結(jié)合多段斜率算法可對所提取的特征值進行準確性驗證．取從第1個點開始后的5個點作為判斷該點運動趨勢的點域，依次取出點域中的點，一階差分計算出5個斜率值為

因此特征點識別規(guī)律為：當trend()＝1，且當前5個斜率值的平均值大于起點斜率即k＞s，當前點認定為譜峰起點；對應(yīng)起點與終點間的最大值認定為頂點；當trend()＝-1之后平緩時當前點認定為譜峰終點．

1.2.3?譜峰校正匹配

由于色譜柱填充問題或樣品污染等因素，使得色譜峰峰形不對稱，導致LC-MS/MS掃描的保留時間漂移與譜峰頂點未能對齊，因此需要對保留時間進行校正．對識別出來的不同濃度樣品峰及其對應(yīng)內(nèi)標峰，進行譜峰匹配，獲得精確保留時間值．

本研究利用二次擬合法對色譜峰形進行校正[11]，將識別出來的所有分析物譜峰及其內(nèi)標峰分別進行分析匹配．取譜峰強度的最高點及其相鄰兩側(cè)各兩個強度值點，通過二次擬合方法對5個點進行擬合，求出二次擬合曲線最大值對應(yīng)的保留時間R，將原掃描的最高點的出峰時間值減去二次擬合后的出峰時間值即為時間平移量，當差值為正時向左平移，差值為負時向右平移，且強度值保持不變，此時窗口內(nèi)的峰頂點對應(yīng)時間即為色譜峰的保留時間．

1.3?譜峰面積計算

定量分析是通過獲取譜圖峰面積來對化合物中各組分含量進行檢測．譜峰面積計算采用將起點與終點相連接作為基線，將基線與峰輪廓線包圍的面積劃分為若干小部分的面積．利用梯形面積計算法，將譜峰按照時間段成比例的分割成等分，每小段近似看成梯形，各小部分面積累加即色譜峰面積，其計算式為

1.4?曲線擬合

加權(quán)回歸方程的斜率和截距可表示為

加權(quán)相關(guān)系數(shù)表示為

普通最小二乘分析方法即具有相同的權(quán)重因子(＝1)，加權(quán)最小二乘法進行數(shù)據(jù)擬合帶有傾向性．因此根據(jù)因變量方差的數(shù)據(jù)波動選擇適當權(quán)重，分析方法的檢測結(jié)果，確定相應(yīng)擬合算法從而建立標準曲線．

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

液相色譜儀(LC-20AX，島津公司)，三重四極桿質(zhì)譜儀(MS/MS，API4000，AB SCIEX公司)，離心機(F138469O，Eppendorf公司)，旋渦混合器(VORTEX-5，其林貝爾儀器公司)，96孔氮吹儀(VSD150-1A，無錫沃信儀器制造有限公司)等．

甲醇(67-56-1，4L)、乙腈(75-05-8，4L)、甲酸(64-18-6，50mL)均為色譜純，購買于Fisher Chemical公司，正己烷(色譜純，110-54-3，2.5L，Sigma-Alorich公司)，牛血清白蛋白(9048-46-8，100g，Amresco公司)．

25-羥基維生素D2、25-羥基維生素D3干粉試劑(1mg/瓶)標準品均購于加拿大多倫多研究化學公司，25-羥基維生素D2-d6、25-羥基維生素D3-d6干粉試劑(1mg/瓶)標準品內(nèi)標均購于Medical Isotopes公司．

2.2?實驗條件

色譜條件：色譜柱為Shim-pack GIST-HP C18(2.1mm×100mm×3μm，島津公司)；流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動相B為0.1%甲酸甲醇溶液；采用梯度洗脫：0～0.5min70%B；0.5～2.0min 70%B；2.0～5.0min100%B；5.0～5.1min100%B；5.1～6.5min70%B．流速為0.5mL/min，柱溫為40℃，進樣量為10μL．

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式，氣簾氣(CUR)壓力103kPa，離子化電壓(IS)5500V，溫度(TEM)設(shè)為350℃，噴霧氣(GS1)壓力414kPa，輔助加熱氣(GS2)壓力448kPa．

2.3?實驗設(shè)計

稱取標準樣品，通過逐級稀釋的方法得到標準樣品基礎(chǔ)工作溶液，以及配制得到已知濃度的質(zhì)控品Q1、Q2，其進樣質(zhì)量濃度如表1所示．通過LC-MS/MS進行檢測，得到每組樣品的質(zhì)量色譜峰及其對應(yīng)內(nèi)標峰的峰面積，采用同位素內(nèi)標法建立標準曲線，對定量分析結(jié)果進行分析．

表1?維生素D2和維生素D3標準樣品進樣質(zhì)量濃度

Tab.1 Vitamin D2 and vitamin D3 pure standard sample injection mass concentration

3?結(jié)果與討論

3.1?譜峰顯示與噪聲分析

根據(jù)上述實驗方法得到維生素D2以及維生素D3的8組生物標準品譜峰及其內(nèi)標峰的質(zhì)量色譜圖，以S5標準品檢測結(jié)果為例見圖1．

圖1?兩種維生素及其內(nèi)標色譜圖

采用信號與噪聲判別算法，對上述原始譜圖進行處理，以樣品S1低濃度下維生素D2檢測為例，如圖2所示，能夠在峰形沒有失真的情況下，去除大部分毛刺噪聲，便于色譜特征點分析．對于信噪比(/)考察發(fā)現(xiàn)，去噪前后信噪比增益明顯提高，且無信號失真現(xiàn)象，峰高失真度在5%以內(nèi)，表明能夠保留信號原始信息，如表2所示．

3.2?譜峰識別與匹配

3.2.1?譜峰識別

以人體血清中維生素D檢測為例，結(jié)合譜峰特征點識別算法對采集得到的原始數(shù)據(jù)進行分析，由于生物基質(zhì)樣品復雜，檢測結(jié)果會出現(xiàn)獨立峰、肩峰、拖尾峰和低濃度峰4種形式的峰形．通過平滑Z-score算法對原始數(shù)據(jù)譜峰區(qū)域進行判定，本實驗中取滑動移動窗口大小為60，上下浮動閾值為1.5，輸出信號為1的位置即為尋找到的譜峰位置．多段斜率法利用相鄰信號點運動趨勢對具有肩峰和拖尾峰等復雜特殊峰形，根據(jù)信號平滑度以及上升下降的趨勢，均可準確識別出特征點位置，如圖3～圖6所示.

圖2?維生素D2去噪前后對比

表2?維生素D3檢測信噪比分析結(jié)果

Tab.2?S/N analysis results of vitamin D3 detection

3.2.2?譜峰匹配

色譜柱填料或樣品前處理溶劑等污染，對每種分析物對應(yīng)的離子流色譜圖往往在不同保留時間下出現(xiàn)多個譜峰，且色譜譜峰的不對稱性會造成保留時間的漂移．對人體血清中維生素D檢測數(shù)據(jù)，采用了二次擬合譜峰校正算法，對分析物及其對應(yīng)內(nèi)標進行保留時間自動校正匹配，如圖7所示．根據(jù)保留時間判斷待測峰，能夠準確匹配出維生素D及其對應(yīng)內(nèi)標峰的位置，解決了峰匹配錯誤對分析結(jié)果的影響．

3.3?曲線擬合權(quán)重比較

通過外標曲線校正的方法，采用加權(quán)最小二乘法對幾種權(quán)重分別進行比較，以人血清中維生素D3檢測結(jié)果為例，如圖8所示，權(quán)重采用1/2時測量的各濃度點相對誤差最小即準確性最佳，這是由于濃度數(shù)據(jù)點隨機誤差的方差在不同濃度點上不是恒定的，因此賦予不同質(zhì)量的回歸．

圖3?獨立峰及識別特征點檢測結(jié)果

圖4?肩峰及識別特征點檢測結(jié)果

圖5?拖尾峰及識別特征點檢測結(jié)果

圖6?低濃度峰及識別特征點檢測結(jié)果

圖7?目標化合物保留時間校正前后對比

圖8?維生素D3在不同擬合權(quán)重下的對比結(jié)果

采用普通最小二乘法與加權(quán)最小二乘法(1/2)分別對人血清中維生素D2、維生素D3的8個標準樣品進行曲線擬合，建立生物標準曲線，如圖9所示．藍色代表普通最小二乘法(ordinary least squares，OLS)，紅色代表加權(quán)最小二乘法(weighted least square，WLS)，兩種方法擬合曲線接近，但對于低濃度區(qū)域采用普通最小二乘法測量結(jié)果的相對誤差較大，高濃度區(qū)域測量結(jié)果相對誤差略?。疄閷Φ蜐舛确秶哟髷M合權(quán)重，最終采用了權(quán)重為1/2的加權(quán)最小二乘法．

圖9?普通最小二乘法和加權(quán)最小二乘法擬合曲線及相對誤差對比

3.4?方法學考察

3.4.1?線性范圍及檢出限

采用自開發(fā)算法包對人體血清中維生素D2和維生素D3的標準樣品建立生物標準曲線，線性相關(guān)系數(shù)均在0.998以上，表明維生素D2在5～40mg/L、維生素D3在5～200mg/L范圍內(nèi)均具有良好線性，其檢出限(limit of detection，LOD)以及定量下限(limit of quantity，LOQ)如表3所示，進一步驗證了開發(fā)算法的準確性[12]．

表3?線性回歸方程、檢出限和定量下限

Tab.3?Linear regression equation，LOD，and LOQ

3.4.2?質(zhì)控品考察

3.4.3?臨床應(yīng)用實例

采用自開發(fā)的定量分析算法對人體血清中脂溶性維生素A和維生素E，血漿中甲氧基腎上腺素(metanephrine，MN)和甲氧基去甲腎上腺素(nor-metanephrine，NMN)兩個臨床應(yīng)用進行檢測，濃度線性范圍及線性回歸方程如表5所示，線性相關(guān)系數(shù)滿足臨床檢測要求，對復雜基質(zhì)生物樣本可以實現(xiàn)自適應(yīng)譜圖信息自動提取，進一步驗證算法普適性．

圖10?連續(xù)6 d檢測維生素D2、維生素D3質(zhì)控品濃度

表4?維生素D2、維生素D3質(zhì)控品檢測結(jié)果及CV值

Tab.4?Vitamin D2 and vitamin D3 quality control test results and CV value

表5?濃度線性范圍及線性回歸方程

Tab.5?Concertration linearityrange and linear regression equation

4?結(jié)?語

本研究采用了自行開發(fā)的液質(zhì)聯(lián)用譜圖信息自動提取算法，以人體血清中維生素檢測應(yīng)用為例，形成基于液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀MRM掃描模式下的配套數(shù)據(jù)處理算法包．對比目前現(xiàn)有識別方法，本文開發(fā)的譜峰識別與校正算法可以對復雜生物基質(zhì)樣品中拖尾峰、肩峰等特殊峰形進行準確識別與匹配，減少優(yōu)化時間．本研究對譜圖去噪、曲線擬合等算法識別結(jié)果進行了驗證，進一步提高譜圖數(shù)據(jù)處理自動化，從而形成一套基于醫(yī)用質(zhì)譜儀軟件平臺的液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀器應(yīng)用軟件系統(tǒng)，為臨床相關(guān)疾病快速檢測診斷提供工具．

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Quantitative Analysis Algorithm of Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometry

Wang Yan1，Liu Haipei1，Sun Chuanqiang1，Han Wennian2，Jia Mingzheng2，Jiang Xuehui1

(1. School of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2. Tianjin Guoke Medical Engineering and Technology Development Company Limited，Tianjin 300399，China)

On the basis of a self-developed triple quadrupole mass spectrometer，a complete set of spectral information extraction and analysis method is designed and developed. This method includes original data denoising，chromatographic analysis and identification，spectral peak matching，curve fitting，and other algorithms. A kind of algorithm which depends on data signals itself and noise characteristic is designed to automatically remove the noise from original mass spectrometry．Smooth Z-score method is used with the multistage slope algorithm of target compounds，chromatographic peak of quality analysis，implementation of complex matrix samples，shoulder peak and low concentration peak，and tailing peak of accurate identification．Then，spectrum peak retention time correction is performed，and the measurement and weights of curve fitting are discussed. Finally，a standard curve for quantitative analysis is established．Taking 25-hydroxy vitamin D in human serum as an example，a set of matching quantitative analysis algorithm package under the MRM scanning mode of liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry was completed by using the self-developed algorithm．Calculation results show that when 1/2weighted linear fitting was selected，the limits of detection for vitamin D2and vitamin D3were 1.1mg/L and 1.5mg/L，respectively，while the limits of quantitation were 3.7mg/L and 5.1mg/L，respectively，and their correlation coefficient was above 0.998．For six consecutive days，the coefficient of variation for vitamin D2and vitamin D3quality control products with high and low concentrations was within 7%，which met the requirements of intra-day precision．Experimental results verified the accuracy of the analysis algorithm．The results of two clinical applications of human serum fat-soluble vitamins A and E and plasma metanephrine and normetanephrine were quantitatively analyzed to further verify the feasibility and universality of the algorithm．This algorithm has self-adaptability，reduces optimization time，improves the automation level of spectral data processing，and can provide tools for the detection and diagnosis of clinically related diseases．

liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry(LC-MS/MS)；peak identification algo-rithm；quantita-tive analysis；vitamin D

O657.63

A

0493-2137(2020)06-0617-09

10.11784/tdxbz201906003

2019-06-06；

2019-07-05.

汪?曣（1955—??），男，碩士，教授，wangyan@tju.edu.cn.

蔣學慧，jiangxuehui82@163.com.

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃資助項目(2014AA022305)．

Supported by the National High Technology Research and Development Program of China(No.2014AA022305).

(責任編輯：孫立華)