齊 欣，劉欣芳，馬 駿，賈鈺瑩，劉曉麗，孟慶國，姜 敏*，李思南

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，遼寧沈陽 110161；2.中國人民解放軍戰(zhàn)略支援部隊信息工程大學(xué)，河南鄭州 450001）

玉米選育新品種的核心環(huán)節(jié)是選育優(yōu)良自交系，而與傳統(tǒng)選育方法不同，單倍體育種技術(shù)可快速、大規(guī)模地創(chuàng)制玉米純系。隨著誘導(dǎo)效率不斷提高，單倍體育種技術(shù)也廣泛地應(yīng)用于育種實踐中[1-2]。但目前對單倍體誘導(dǎo)遺傳機理的研究多是以F1代誘導(dǎo)加倍形成的DH 群體為研究材料，而不同回交世代DH 系之間的遺傳分析報道較少。該研究以“A619Ht3×遼3162”構(gòu)建回交群體BC1F1和BC5F1，利用高頻誘導(dǎo)系遼誘1 號[3]誘導(dǎo)加倍形成2 個回交世代BC1F1和BC5F1的DH 群體，從株高、穗位高、穗長、穗行數(shù)、穗粗、行粒數(shù)等農(nóng)藝性狀進行分析，結(jié)合SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，闡明不同回交世代DH 系之間的遺傳變異規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 DH 群體的獲得。以遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米所選育的遼誘1 號誘導(dǎo)“A619Ht3×遼3162”的回交群體BC1F1和BC5F1產(chǎn)生單倍體，通過自然加倍得到回交群體DH 系各50 個。

1.1.2 SSR 反應(yīng)體系。采用CTAB 法（2% CTAB，1M Tris-HCl，5M NaCl，0.5M EDTA 混合液）提取親本及DH 系的總DNA，按照康為世紀(jì)2*Es Taq MasterMix配制20 μL PCR 反應(yīng)體系，Mix 10 μL，Pirmer 2 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗。2 個回交群體的各50 個DH 系和回交親本于2017 年春種植在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南地試驗區(qū)，完全隨機區(qū)組設(shè)計，每個DH 系種植1行，行長3 m，每行11 株，每個群體3 次重復(fù)。在大喇叭口期取葉片，儲存于超低溫冰箱，以備提取DNA。田間調(diào)查株高、穗位高，室內(nèi)考察穗長、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)等農(nóng)藝性狀。

1.2.2 SSR 分子標(biāo)記。選取均勻分布在玉米10 條染色體上的SSR 引物（引物序列從www.maizegdb.org網(wǎng)站獲得），由北京賽百盛公司合成總計100 對。利用這些引物對親本遼A619Ht3 和遼3162 進行多態(tài)性篩選，用4%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 結(jié)果進行檢測，從中篩選出20 對能清晰分辨出親本的SSR 引物用于DH 群體的分析。

1.3 統(tǒng)計分析方法

采用SPSS、EXCEL 軟件對DH 系的農(nóng)藝性狀進行方差分析、變異系數(shù)以及有關(guān)統(tǒng)計計算。SSR 結(jié)果分析參照Senior 等[4]方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 DH 群體農(nóng)藝性狀方差分析

從表1 可以看出，100 個DH 系在株高、穗位高、穗長、穗行數(shù)、穗粗、行粒數(shù)等6 個重要性狀上的差異均達到極顯著水平，說明各性狀在回交群體DH系間存在顯著差異性。

2.2 不同回交世代DH 群體變異性分析

從表2 可以看出，低回交世代BC1F1所構(gòu)成的回交群體的穗位高、穗長、穗行數(shù)、穗粗、行粒數(shù)各性狀的變異系數(shù)均大于BC5F1所構(gòu)成的回交群體，而株高的變異系數(shù)略小于BC5F1所構(gòu)成的回交群體。其中穗位高變異系數(shù)最大，為0.157 和0.134，變異系數(shù)最小的是穗粗，為0.057 和0.046。

2.3 各性狀間的相關(guān)性分析

從表3 可以看出，株高與穗位高、穗長，穗長與穗粗、行粒數(shù)，穗行數(shù)與穗粗相關(guān)性達到極顯著水平，分別為0.631、0.535、0.329、0.684、0.619。株高與穗粗、行粒數(shù)，穗位高與穗長，穗粗與行粒數(shù)達到顯著水平，為別為0.286、0.273、0.266、0.201。

2.4 DH 群體的遺傳分離分析

從100 對SSR 引物中篩選親本中具有多態(tài)性的引物，圖1 為部分SSR 引物篩選結(jié)果，從圖1 可見，大部分引物都不具有多態(tài)性，其中有2 對引物具有多態(tài)性。在100 個標(biāo)記中共篩選出20 個分子標(biāo)記在2 個親本間都具有不同的帶型，DH 系具有親本之一的帶型。圖2 為umc1546 分子標(biāo)記分離的瓊脂糖凝膠電泳，其中1 為A619Ht3 帶型，2 為遼3162帶型，其余為各DH 系帶型。

表1 DH 系各性狀的方差分析

表2 不同回交世代DH 群體變異系數(shù)

表3 各性狀間的相關(guān)性分析

在50 個BC1F1DH 系中，所用引物都沒有表現(xiàn)出明顯偏離1∶3 比率的分離?？ǚ綑z驗結(jié)果表明所用的20 對引物分子標(biāo)記的χ2值在0. 003～2.24，差異較大的有8 號染色體上的umc2356 和bnlg2181，未達到顯著水平（表4），所以在DH 系群體中2 個親本的SSR 標(biāo)記在DH 系中未發(fā)現(xiàn)明顯偏分離的現(xiàn)象。

表4 SSR 分子標(biāo)記在BC1F1 所構(gòu)成DH 群體的分布

3 結(jié)論與討論

DH 系在主要農(nóng)藝性狀上均表現(xiàn)為高度的一致性且其變異分布范圍與RIL 基本一致[5]。試驗結(jié)果表明，不同回交世代所創(chuàng)制的DH 系在主要農(nóng)藝性狀上均表現(xiàn)為高度的一致性，并在株高、穗位高等重要性狀上的差異均達到極顯著水平，高世代的DH 系各農(nóng)藝性狀在變異系數(shù)上除了株高外，其他均小于低世代的DH 系，這可能與高世代回交群體更接近于親本有關(guān)，但其所產(chǎn)生的DH 系應(yīng)有豐富的變異類型。

在雜交后代群體中，某一位點基因型分離比例的觀察值不符合孟德爾分離比例的一種現(xiàn)象稱為偏分離，偏分離產(chǎn)生的原因是雜交親本之間存在不相容性[6-7]，在自然界中，偏分離是常見的現(xiàn)象。在玉米DH 系的研究上，Beuamont 利用玉米花粉離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)了偏分離現(xiàn)象[8]。而近年來，隨著玉米孤雌生殖的應(yīng)用，也有大量的應(yīng)用DH 或孤雌生殖單倍體進行偏分離研究的報道[9-11]。該研究用20 個SSR 引物對BC1F1DH 系進行研究，沒有發(fā)現(xiàn)偏分離現(xiàn)象，從一定程度上說明了孤雌生殖誘導(dǎo)系分離的穩(wěn)定性，同時隨著應(yīng)用標(biāo)記數(shù)量的擴大和群體數(shù)量的增加，可能會發(fā)現(xiàn)偏分離現(xiàn)象。