閆沛春 陳長興 陳劍 丁懷利 李民

【摘 要】目的：探討透骨消痛膠囊對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨下骨Wnt/β-catenin信號通路表達的影響。方法：將60只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、透骨消痛膠囊組，每組20只。除空白對照組外，其余大鼠采用改良Hulth法建造膝骨關(guān)節(jié)炎模型?？瞻讓φ战M、模型對照組給予生理鹽水灌胃，透骨消痛膠囊組給予10 mg·mL-1透骨消痛膠囊溶液灌胃。干預后，置于麻醉下取材，經(jīng)RT-PCR、Western Blot分別檢測軟骨下骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA與蛋白含量變化。結(jié)果：RT-PCR、Western Blot結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組大鼠軟骨下骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA與蛋白含量表達顯著升高（P < 0.01）;與模型對照組比較，透骨消痛膠囊組大鼠軟骨下骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA與蛋白含量表達顯著降低（P < 0.01或P < 0.05）。結(jié)論：透骨消痛膠囊可通過調(diào)控改良Hulth法制備的膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型軟骨下骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA與蛋白含量表達，從而延緩膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨硬化。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝;軟骨下骨;透骨消痛膠囊;Wnt/β-catenin信號通路;大鼠

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effect of Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛膠囊）on the expression of signal molecules related to Wnt/β-catenin pathway in subchondral bone of knee osteoarthritis rats.Methods：Sixty SD rats were randomly divided into a blank control group，a model control group and a Tougu Xiaotong Jiaonang group，with 20 rats in each group.The knee osteoarthritis rat models were established with rats other than the blank control group with the modified Hulth method.Rats in the blank control group and the model control group were given normal saline，while those in the Tougu Xiaotong Jiaonang group were given 10 mg·mL-1 of Tougu Xiaotong Jiaonang solution.After intervention，the samples were taken under anesthesia.The content of Wnt4，GSK-3β，β-catenin mRNA and protein in subchondral bone were detected by RT-PCR and Western Blot.Results：RT-PCR and Western Blot showed that compared with the blank control group，the expression of Wnt4，GSK-3β，β-catenin mRNA and protein in the subchondral bone of the model control group was significantly increased（P < 0.01）;while those in the the model control group was significantly decreased（P < 0.01 or P < 0.05）.Conclusion： Tougu Xiaotong Jiaonang can regulate the expression of Wnt4，GSK-3β，β-catenin mRNA and protein in subchondral bone of knee osteoarthritis rat model prepared by modified Hulth method，so as to delay the subchondral osteosclerosis of knee osteoarthritis.

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種多發(fā)于中老年患者的慢性關(guān)節(jié)疾病，其主要特征包括膝關(guān)節(jié)軟骨退行性改變、關(guān)節(jié)間隙變小、軟骨下骨厚度增加、骨贅形成、滑液成分改變等表現(xiàn)[1]。其中促使關(guān)節(jié)退變加劇主要是生物因素和力學因素的異常改變[2]，兩者的共同作用導致了軟骨細胞、細胞外基質(zhì)、軟骨下基質(zhì)三者降解和合成失衡，最終形成一種慢性、進展性的關(guān)節(jié)疾病[3]。KOA發(fā)病的危險因素包括年齡、性別、體質(zhì)量等[4]，但具體發(fā)病機制目前尚未完全闡明。當前研究顯示，軟骨下骨的異常變化與軟骨下骨的硬化及KOA的發(fā)生、發(fā)展具有重要相關(guān)性[5]。而KOA軟骨下骨硬化，屬于中醫(yī)學“膝骨痹”范疇，其最主要的病機是“本痿標痹”“本虛標實”，故其治則為溫腎補陽柔肝、活血祛風除濕[6]。透骨消痛膠囊是福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑（批準文號：閩制字Z20100006），由巴戟天、杭白芍、川芎和腫節(jié)風組成，具有溫補腎陽、養(yǎng)血斂肝、活血行血、化濕祛風的功效，臨床上治療KOA具有較好的效果[7-8]。從藥物功效來看，巴戟天補腎助陽、祛風除濕，白芍緩急止痛、養(yǎng)血柔肝，川芎、腫節(jié)風祛風通絡。諸藥合用，使邪去痹除，肝腎同健，氣血充養(yǎng)，邪正兼顧，發(fā)揮了“從本治痿，從標治痹”作用，切中KOA的病因病機，對其治療具有一定療效。

2.4 Western Blot 檢測軟骨下骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白含量表達 取出待檢各組大鼠軟骨下骨組織，提取各組總蛋白，BCA法進行蛋白定量，精確添加相關(guān)試劑。首先配制體積分數(shù)為12%的下層膠（分離膠），利用蒸餾水重力施壓膠面確保同水平面后，待其凝固后吸凈上層蒸餾水;再配制體積分數(shù)為5%的上層膠（濃縮膠）予以灌板，同時迅速插入梳子，待其完全凝固拔出梳子備用;然后以每孔20 μg進行上樣，后依次經(jīng)電泳（前10 min調(diào)至20 V電壓，后于50 V電壓下運行30 min，然后設(shè)置100 V電壓跑至膠底）、轉(zhuǎn)膜（電流為1.3 A、電壓25 V）、封閉;再將各條膜放入提前配制完畢的Wnt4（1 μg·mL-1）、GSK-3β（1∶5000）、β-catenin （1∶4000）、β-actin（1∶1000）待檢指標的一抗反應袋中，轉(zhuǎn)移至低溫環(huán)境（4 ℃），在振蕩搖床勻速作用下，反應過夜，進行充分一抗孵育;后轉(zhuǎn)移至二抗（羊抗兔，濃度為1∶5000）反應袋中，使其發(fā)生抗體結(jié)合反應，標記并擴大一抗信號;后將各條待檢膜帶置于高敏ECL顯影液中反應，經(jīng)曝光成像（凝膠成像儀），得出數(shù)據(jù)進行保存、分析。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，2組間比較采用t檢驗與單因素方差分析;計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 RT-PCR檢測結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示，透骨消痛膠囊作用于KOA大鼠軟骨下骨后，可下調(diào)Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA含量表達。與空白對照組比較，模型對照組Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA含量表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），提示KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨下骨發(fā)生一定程度的退變。與模型對照組比較，透骨消痛膠囊組Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA含量呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01），提示透骨消痛膠囊可通過調(diào)控KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨下骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA表達，在一定程度上抑制KOA病理進程。見表2、圖1。

3.2 Western Blot檢測結(jié)果 Western Blot結(jié)果顯示，透骨消痛膠囊作用于KOA大鼠軟骨下骨后，可下調(diào)Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白含量表達。與空白對照組比較，模型對照組Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白含量表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），提示KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨下骨發(fā)生一定程度的退變。與模型對照組比較，透骨消痛膠囊組Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白含量呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01），提示透骨消痛膠囊可通過調(diào)控KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨下骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白含量表達，在一定程度上抑制KOA病理進程。見表3、圖2。

4 討 論

關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨在解剖結(jié)構(gòu)、生理功能及病理反應上是相互聯(lián)系、相互作用的，是不可分割的統(tǒng)一整體。軟骨和軟骨下骨被認為是OA進展的復合關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，關(guān)節(jié)軟骨的磨損會隨著關(guān)節(jié)炎的不斷加重而越來越嚴重，同時軟骨下骨也會因為軟骨的變化，發(fā)生相應的力學變化，軟骨下骨的剛度增加，進一步導致關(guān)節(jié)軟骨的力學緩沖下降，加重力學的損傷[12]，從而加重KOA癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，引起或加重關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)的改變、加劇KOA軟骨退變的主要原因是軟骨下骨骨量和厚度發(fā)生變化，從而改變組織的生物力學特點所致[13]。一些研究認為，KOA軟骨下骨的變化主要是骨重塑，尤其在KOA早期階段的骨重塑是以骨形成為主[14-15]。但亦有研究表明，KOA早期的骨重塑以骨吸收為主[16-17]，軟骨下骨的骨吸收增加后導致暫時性骨量減少是OA的主要特點[18]，且有較多研究表明，減少關(guān)節(jié)疼痛，延緩軟骨退變的方式是抑制或改善軟骨下骨的異常改變[1]。

Wnt信號通路分為經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路，其依據(jù)為是否依賴β-catenin的參與。在骨的生長發(fā)育及代謝方面，經(jīng)典Wnt信號通路（即Wnt/β-catenin通路）是骨細胞作用的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在維持關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)中起重要作用，且參與、調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨下骨和軟骨的生長發(fā)育和代謝，在OA的發(fā)展過程中，Wnt通路活性的改變影響軟骨下骨生長板破骨細胞活性，從而導致軟骨下骨硬化或關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成[19];其能夠調(diào)節(jié)軟骨、骨以及關(guān)節(jié)的形成，在軟骨生成、調(diào)節(jié)軟骨細胞表型及維持基質(zhì)的完整性方面發(fā)揮重要作用;并且可以延長軟骨細胞生命周期，抑制其分化為肥大細胞[20]。

動物實驗證明，Wnt/β-catenin通路對骨密度和骨礦化程度的調(diào)節(jié)較為重要[21]。另有研究表明，Wnt/β-catenin通路在參與關(guān)節(jié)的胚胎發(fā)育、維持成人骨骼穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用，是軟骨在胚胎發(fā)育、關(guān)節(jié)形成過程中不可或缺的重要調(diào)控機制[22]。因此，導致軟骨組織發(fā)生結(jié)構(gòu)性破壞主要是與軟骨細胞發(fā)生肥大增生、細胞外基質(zhì)分泌停止有關(guān)，而軟骨組織表面β-catenin的增加是造成軟骨細胞及細胞外基質(zhì)發(fā)生改變的重要原因，最終加重OA的發(fā)展[23]。有文獻顯示，一旦抑制GSK-3β的活性，則可促進β-catenin聚集在細胞內(nèi)，表明GSK-3β對Wnt通路具有負調(diào)節(jié)作用，從而減緩軟骨骨化的進程與惡化[24]。

課題組前期實驗研究表明，在KOA發(fā)病過程中，加速關(guān)節(jié)軟骨退變的因素是軟骨下骨重塑后造成的硬化和結(jié)構(gòu)紊亂，而透骨消痛膠囊則可通過調(diào)整c-fos、c-jun、Cyclin D1 mRNA的表達，降低軟骨下骨重塑速率;降低RANKL mRNA表達，減少OA發(fā)病早期軟骨下骨吸收，抑制OA發(fā)病中后期軟骨下骨形成，從而改善軟骨下骨形態(tài)，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變[25-26]。本研究基于Wnt/β-catenin信號通路，采用Western Blot、RT-PCR技術(shù)多層面、多角度從Wnt/β-catenin信號通路探討OA軟骨下骨硬化的機制及透骨消痛膠囊的干預作用，結(jié)果表明，透骨消痛膠囊作用于KOA大鼠軟骨下骨后，可下調(diào)Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA與蛋白含量表達，進而延緩KOA病理進程。今后可從微觀層面如miRNAs角度，進一步探討透骨消痛膠囊對于軟骨下骨的發(fā)育成長與代謝等方面作用影響，以利于進一步闡明其作用機制。

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收稿日期：2019-07-10;修回日期：2019-08-23