馮靜云， 牛 歡， 黃建國(guó)， 張超群， 張露露，尚云濤， 范寶莉， 劉曉穎， 王振英

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；3.天津師范大學(xué) 天津市水資源與水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

小麥?zhǔn)鞘澜缟蠌V泛栽培的農(nóng)作物之一，布氏白粉菌（Blumeria graminis f.sp.Tritici）可引起小麥真菌病害，嚴(yán)重時(shí)可造成13%～34%的減產(chǎn)[1].研究病原菌與小麥互作的分子機(jī)理有助于獲得更多的抗病種質(zhì)資源，培育抗病品種，從根本上解除白粉病對(duì)小麥產(chǎn)量造成的危害.

在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物自身形成了一套抵抗外界病原菌感染的免疫防御系統(tǒng)，包括分子模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)（pattern-triggered immunity，PTI）和效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（effector-triggered immunity，ETI）[2-3].植物在受到病原菌侵染時(shí)會(huì)發(fā)生PTI 反應(yīng)， 導(dǎo)致植物體內(nèi)發(fā)生一系列變化， 從而激活下游反應(yīng)通路.蛋白激酶作為防御系統(tǒng)的重要組成部分， 在植物生長(zhǎng)發(fā)育、識(shí)別病原體等方面起到十分關(guān)鍵的作用[4-5].目前，根據(jù)底物蛋白被磷酸化的氨基酸殘基種類，將真核生物的蛋白激酶大致分為：①絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase， STPK）；②酪氨酸蛋白激酶（tyrosine proteinkinase，TPK）；③組氨酸蛋白激酶；④色氨酸蛋白激酶；⑤天冬氨酞基/谷氨酞基蛋白激酶[6].蛋白激酶家族基因能夠參與不同植物的防御反應(yīng)，在植物代謝過(guò)程中起到重要作用.2011 年，Cao 等[7]在小麥-簇毛麥易位系T6VS.6AL 中，克隆得到Stpk-V，該基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， 定位在Pm21 核心區(qū)，過(guò)表達(dá)該基因可明顯提高感病小麥Yangmai 158 的抗病性.2016 年，楊亞洲[8]從小麥的cDNA 文庫(kù)中分離得到TaTPK 蛋白激酶基因，通過(guò)基因轉(zhuǎn)化成功獲得了T6代轉(zhuǎn)基因小麥株系，發(fā)現(xiàn)該基因具有抗旱、耐高鹽雙重特性.蛋白激酶是一類龐大的家族， 有著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制.其中，蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）在細(xì)胞生長(zhǎng)分化、 代謝發(fā)育等過(guò)程起到重要的調(diào)節(jié)作用.2003 年，Dickman 等[9]利用 4 種 PKC 特異性抑制劑，發(fā)現(xiàn)PKC 表達(dá)降低后，紫花苜蓿炭疽病病原菌的孢子萌發(fā)和附著胞的形成受到抑制.2011 年，趙巍[10]同樣利用PKC 特異性抑制劑，發(fā)現(xiàn)PKC 基因表達(dá)被抑制后，玉米大斑病菌孢子的萌發(fā)率及附著胞形成受到了嚴(yán)重影響.上述研究均表明，PKC 在病原菌孢子萌發(fā)、附著胞芽管侵入宿主細(xì)胞以及成功侵染宿主后形成次級(jí)菌絲等方面發(fā)揮著重要作用.

本課題組利用cDNA-AFLP 技術(shù)研究抗病小麥和感病小麥對(duì)白粉菌脅迫的基因表達(dá)差異時(shí)，在感病材料中獲得了1 個(gè)表達(dá)下調(diào)基因片段[11].本研究以該片段為基礎(chǔ)，結(jié)合中國(guó)春小麥的基因組信息，克隆了1 個(gè)STPK-CCR3 基因.通過(guò)生物信息學(xué)、 白粉菌侵染后該基因的表達(dá)模式以及基因沉默分析，探究該基因在小麥與病原菌互作過(guò)程中發(fā)揮的作用.研究豐富了病原菌與植物互作的信息資源， 為STPK-CCR3 基因在小麥分子育種中的應(yīng)用提供理論支持.

1 材料和方法

1.1 材料

植物材料為白粉病敏感品種小麥京411； 菌株為白粉菌生理小種E09； 病毒材料為大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus，BSMV）.

1.2 試劑

RNAiso Plus Total RNA 提取試劑、高保真 DNA 聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒和DNA marker 等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；Ribo－MAX Large Scale RNA Production-T7 試劑盒和M-MLV反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑等購(gòu)自美國(guó)Promega 公司.

1.3 引物

由金唯智生物科技有限公司天津分公司合成相關(guān)引物，序列信息如表1 所示.

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primer

1.4 TaSTPK-CCR3基因克隆及序列分析

提取小麥京411 總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性，Nanodrop1000 檢測(cè)其質(zhì)量和濃度.以O(shè)ligo（dT）15為引物，根據(jù) Promega 公司的 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA.以實(shí)驗(yàn)室前期獲得的差異片段為基礎(chǔ)， 根據(jù)中國(guó)春小麥基因組信息設(shè)計(jì)STPK-CCR3基因引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增.擴(kuò)增體系為：5×PSGXL Buffer 5 μL，dNTP Mix 2 μL，STPK-CCR3-F/R 0.5 μL，cDNA 1 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.5 μL，無(wú)菌水15.5 μL.PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min； 35 cycles of 98 ℃ 10 s， 58 ℃ 15 s，68 ℃ 2 min；68 ℃ 7 min； 4 ℃保存.將PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收后連接到pGEM-T easy 載體上， 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序.

測(cè)序結(jié)果提交至NCBI GenBank 進(jìn)行 Blastx 比對(duì)，分析該基因的結(jié)構(gòu)功能域及所屬基因家族，利用DNAMAN、MEGA5.0 等軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

1.5 白粉菌誘導(dǎo)下TaSTPK-CCR3表達(dá)模式分析

培養(yǎng)小麥京411，待小麥長(zhǎng)至一葉一心期時(shí)，采用抖拂法將白粉菌生理小種E09 的分生孢子接種在小麥葉片上，在接種 0、2、4、8、12、24、48 和 72 h 后，取相同部位的葉片存于-80 ℃冰箱.提取小麥葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.根據(jù)TaSTPK-CCR3 基因序列信息，在其特異性區(qū)域設(shè)計(jì)定量引物STPK-CCR3-QRT-F和STPK-CCR3-QRT-R.以小麥Actin 作為內(nèi)參基因，對(duì)白粉菌誘導(dǎo)后TaSTPK-CCR3 基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析.擴(kuò)增長(zhǎng)度為142 bp，總體系為20 μL，其中，2×Mix（SYBRRGreen）緩沖液 10 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，無(wú)菌水 7 μL.擴(kuò)增程序?yàn)椋?0 ℃2 min；95 ℃ 10 min； 40 cycles of 95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s.

1.6 TaSTPK-CCR3基因沉默重組載體構(gòu)建及沉默效率檢測(cè)

根據(jù)序列信息，在基因的非保守區(qū)設(shè)計(jì)上、下游特異引物STPK-CCR3-VIGS-F 和STPK-CCR3-VIGS-R，以感病小麥京411 的普通cDNA 為模板擴(kuò)增基因片段，在T4 連接酶的作用下，將回收的片段與BSMVγ：載體骨架16 ℃連接18 h 以上，構(gòu)建方法主要參見(jiàn)文獻(xiàn)[11].

提取含病毒載體的質(zhì)粒 BSMVα、BSMVβ、BSMVγ：GFP、BSMVγ：PDS及 BSMVγ：TaSTPK-CCR3， 線性化后進(jìn)行酚仿抽提.根據(jù)Promega 公司 RiboMAX Large Scale RNA Produc tion-T7 試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄， 獲得病毒RNA.待感病小麥京411 第2 葉完全展開(kāi)時(shí)進(jìn)行摩擦接種.實(shí)驗(yàn)設(shè)置以下幾個(gè)組別：GKP Buffer 對(duì)照組（以水、GKP Buffer 等體積混合作為摩擦接種介質(zhì)）、BSMV： GFP 對(duì)照組和 BSMV： PDS 對(duì)照組、BSMV：TaSTPK-CCR3 實(shí)驗(yàn)組.待各組植株長(zhǎng)出第 3 葉，BSMV：PDS 組出現(xiàn)葉片白化時(shí)說(shuō)明體系構(gòu)建成功.用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)接種白粉菌前對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中TaSTPK-CCR3 基因表達(dá)水平的變化， 進(jìn)而確定TaSTPK-CCR3 基因表達(dá)是否降低.

1.7 TaSTPK-CCR3基因敲減后對(duì)白粉菌孢子發(fā)育進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察

取各組接種白粉菌2、3 和7 d 的小麥葉片，經(jīng)48 h脫色后，用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色4～8 h.顯微鏡（20×）下，隨機(jī)選取5 個(gè)視野（200 個(gè)細(xì)胞/視野）觀察葉片上白粉菌孢子的發(fā)育情況，包括分生孢子、喙型附著胞和畸形附著胞（分瓣型和纖細(xì)型）等，統(tǒng)計(jì)以上數(shù)據(jù).計(jì)算白粉菌孢子成功侵染率和畸形率，利用Origin 9軟件進(jìn)行分析.計(jì)算公式為

白粉菌孢子成功侵染率（%）=喙型附著胞/（喙型附著胞+畸形附著胞+分生孢子）×100；

白粉菌孢子畸形率（%）=畸形附著胞/（喙型附著胞+畸形附著胞+分生孢子）×100.

1.8 TaSTPK-CCR3基因敲減后植株葉片的表型觀察

為了進(jìn)一步討論TaSTPK-CCR3 基因表達(dá)被抑制后，感病小麥京411 對(duì)白粉菌的敏感程度變化，選取各組生長(zhǎng)情況相同的植株，分別接種新鮮的白粉菌孢子，7 d 后觀察白粉菌在各組葉片上的生長(zhǎng)狀況.

2 結(jié)果與分析

2.1 TaSTPK-CCR3基因克隆及生物信息學(xué)分析

本研究克隆得到 1 個(gè) TaSTPK-CCR3 基因的cDNA 全長(zhǎng)序列，包含開(kāi)放閱讀框1 644 bp，預(yù)測(cè)編碼547 個(gè)氨基酸殘基， 預(yù)計(jì)相對(duì)分子質(zhì)量為61.41×103.在NCBI GenBank 上進(jìn)行Blastx 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因的保守結(jié)構(gòu)域主要包括蛋白激酶超家族類似催化域PKc_like superfamily 和ATP 結(jié)合位點(diǎn)等，如圖1 所示.在IWGSC（www.wheatgenome.org）網(wǎng)站，利用中國(guó)春小麥基因組信息進(jìn)行基因序列的同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因在2D、2B 和2A 染色體上均有同源性較高區(qū)段.基因組注釋信息表明，2D 染色體上蛋白激酶基因TraesCS2D01G062100.1 與STPK-CCR3 基因同源性最高，推測(cè)該基因位于2D 染色體上.

將TaSTPK-CCR3 氨基酸序列與烏拉爾圖小麥（Triticum urartu，Tu）、粗山羊草（Aegilops tauschii，Ata）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon，Bd）、短花藥野生稻（Oryza brachyantha， Ob）、水稻（Oryza sativa， Os）和谷子（Setaria italica，Si）等 6 種植物中的 STPK-CCR3序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，結(jié)果如圖2 所示.

TaSTPK-CCR3 與其他物種STPK-CCR3 同源序列的同源性保持在47%～75%之間，同源性最高達(dá)到74.21%， 說(shuō)明TaSTPK-CCR3 在進(jìn)化過(guò)程中具有較高的保守性.

圖1 TaSTPK-CCR3 結(jié)構(gòu)域Fig.1 Domain composition of TaSTPK-CCR3

圖2 TaSTPK-CCR3的同源序列比對(duì)Fig.2 Alignment of TaSTPK-CCR3 with its homologues

利用MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖3所示.由圖3 發(fā)現(xiàn)，TaSTPK-CCR3 與粗山羊草STPKCCR3 的親緣關(guān)系最為接近，說(shuō)明TaSTPK-CCR3 屬于STPK-CCR3 的蛋白家族.

圖3 STPK-CCR3蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of STPK-CCR3 proteins family

2.2 白粉菌誘導(dǎo)下TaSTPK-CCR3表達(dá)模式分析

以京411 小麥為實(shí)驗(yàn)材料，TaActin 作為內(nèi)參基因， 分析白粉菌侵染后TaSTPK-CCR3 基因的表達(dá)模式，結(jié)果如圖4 所示.由圖4 可以看出，TaSTPK-CCR3基因的本底表達(dá)水平較高，隨白粉菌侵染時(shí)間的增加呈現(xiàn)出一定的波動(dòng).白粉菌侵染2 hpi 后表達(dá)量迅速下調(diào)，侵染4 hpi 后降至最低，之后表達(dá)量有所回升但均低于本底表達(dá).

圖4 白粉菌侵染后TaSTPK-CCR3 基因的表達(dá)模式分析Fig.4 Expression analysis of TaSTPK-CCR3 gene after Bgt inoculation

2.3 TaSTPK-CCR3基因沉默效率檢測(cè)

以感病小麥京411 為實(shí)驗(yàn)材料，待第2 葉完全展開(kāi)時(shí)進(jìn)行摩擦接種，對(duì)各組植株第3 葉進(jìn)行表型觀察.接種病毒RNA 后，BSMV：PDS 對(duì)照組葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象，而在其他組中葉片呈綠色，說(shuō)明沉默體系構(gòu)建成功.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)， 檢測(cè)病毒成功侵染后（未接種白粉菌）TaSTPK-CCR3 基因轉(zhuǎn)錄水平變化，結(jié)果如圖5 所示.由圖5 可以看出，同對(duì)照組相比，在接種病毒RNA 后，實(shí)驗(yàn)組中TaSTPK-CCR3 基因的表達(dá)水平明顯降低，說(shuō)明小麥內(nèi)源基因TaSTPK-CCR3的表達(dá)被有效抑制.

圖5 TaSTPK-CCR3 基因的沉默效率檢測(cè)Fig.5 Effectiveness of TaSTPK-CCR3 silenced by VIGS

2.4 TaSTPK-CCR3基因敲減對(duì)白粉菌孢子發(fā)育的影響

為了檢測(cè)TaSTPK-CCR3 基因?qū)π←湴追劬鷳?yīng)答反應(yīng)的貢獻(xiàn)， 利用基因沉默技術(shù)降低了該基因的表達(dá)，對(duì)基因敲減后的小麥葉片接種白粉菌，觀察接種白粉菌2、3 和7 d 后各組小麥葉片上白粉菌孢子的生長(zhǎng)發(fā)育情況，結(jié)果如圖6 所示.由圖6 可知，接種白粉菌 2 d 后，實(shí)驗(yàn)組（BSMV：TaSTPK-CCR3）小麥葉片上的白粉菌分生孢子萌發(fā)情況不佳，出現(xiàn)分瓣型畸形附著胞（lobed appressoria，LA），如圖6（c）所示，而 2 個(gè)對(duì)照組（GKP Buffer 對(duì)照組和 BSMV：GFP 對(duì)照組）形成大量喙型附著胞，如圖6（a）和圖6（b）所示，圖中AGT為附著胞芽管（appressorium germ tube）.白粉菌侵染3 d后，實(shí)驗(yàn)組中僅有少量白粉菌分生孢子發(fā)育成喙型附著胞，如圖6（f）所示，而對(duì)照組中形成大量的次級(jí)菌絲（sec-ondary hypha，SH），如圖6（d）和 6（e）所示.白粉菌侵染7 d 后，實(shí)驗(yàn)組中形成少量次級(jí)菌絲，如圖6（i）所示，而對(duì)照組已經(jīng)出現(xiàn)大量的念珠狀分生孢子（beaded conidia，BC），如圖6（g）和圖6（h）所示.

白粉菌侵染小麥不同時(shí)間后，孢子成功侵染率和畸形率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖7 所示.由圖7 可以看出，實(shí)驗(yàn)組葉片上白粉菌孢子成功侵染率明顯低于2 個(gè)對(duì)照組，孢子畸形率則高于2 個(gè)對(duì)照組.

2.5 TaSTPK-CCR3基因表達(dá)量降低對(duì)白粉菌生長(zhǎng)進(jìn)程的影響

分別在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組葉片上接種新鮮的白粉菌孢子，接種7 d 后，觀察各組小麥葉片白粉菌生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖8 所示.由圖8 可以看出，實(shí)驗(yàn)組小麥葉片上出現(xiàn)少量白粉菌菌斑，而2 個(gè)對(duì)照組葉片上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的白粉菌孢子堆.進(jìn)一步說(shuō)明抑制TaSTPKCCR3 表達(dá)導(dǎo)致白粉菌孢子萌發(fā)率降低， 減緩了白粉菌的生長(zhǎng)進(jìn)程.

圖6 白粉菌發(fā)育情況的顯微形態(tài)學(xué)觀察Fig.6 Microscopic examination of Bgt infection on leaf of Jing411

圖7 接種白粉菌后植株白粉菌孢子發(fā)育統(tǒng)計(jì)Fig.7 Statistical analyses of spore development after Bgt infection

圖8 接種白粉菌7 d 后京411 葉片上白粉菌的生長(zhǎng)情況Fig.8 Resistant response to Bgt of Jing411 following 7 d of inoculation

3 討論與結(jié)論

3.1 蛋白激酶參與植物防御反應(yīng)

植物抗病性及其響應(yīng)機(jī)制一直是植物分子育種中研究的熱點(diǎn)問(wèn)題.1971 年，F(xiàn)lor[12]通過(guò)對(duì)亞麻抗銹性的研究提出了基因?qū)蚣僬f(shuō).該假說(shuō)認(rèn)為植物在受到病原菌侵染后，體內(nèi)抗性基因所編碼的產(chǎn)物能夠?qū)Σ≡臒o(wú)毒Avr 基因編碼的產(chǎn)物進(jìn)行識(shí)別，進(jìn)而激發(fā)植物的防御反應(yīng)系統(tǒng).蛋白激酶作為防御系統(tǒng)重要的組成部分，以磷酸化和去磷酸化的方式調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程、參與抗性反應(yīng)[13-14].本研究克隆得到了1個(gè)STPK-CCR3 基因的cDNA 全長(zhǎng)序列，經(jīng)NCBI/Blastx比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它屬于PKc_like 超家族，與粗山羊草AtaSTPKCCR3（XP_020154056.1）具有74.21%的同源性.

3.2 抑制TaSTPK-CCR3基因表達(dá)改變京411小麥對(duì)白粉菌的敏感度

VIGS 作為一項(xiàng)反向遺傳學(xué)技術(shù)[15-16]，現(xiàn)已成為植物基因功能研究的重要手段[17-18].本研究利用大麥條紋花葉病毒感染小麥葉片，病毒在此過(guò)程中可能會(huì)對(duì)植物造成一定傷害[19].為了降低系統(tǒng)誤差，設(shè)置了GKP Buffer 對(duì)照組、BSMV： GFP 對(duì)照組、BSMV： PDS 對(duì)照組和BSMV：STPK-CCR3 實(shí)驗(yàn)組.研究結(jié)果顯示，病毒侵染后，2 個(gè)對(duì)照組小麥正常生長(zhǎng)，未出現(xiàn)病斑，說(shuō)明病毒沒(méi)有對(duì)葉片生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯影響.在接種白粉菌2、3 和7 d 后， 實(shí)驗(yàn)組白粉菌孢子侵染率低于2 個(gè)對(duì)照組， 孢子畸形率高于2 個(gè)對(duì)照組.在接種白粉菌7 d后，實(shí)驗(yàn)組葉片上僅有少量白粉菌菌斑，而對(duì)照組葉片上有肉眼可見(jiàn)的白粉菌孢子堆.排除系統(tǒng)誤差，對(duì)比各組葉片表型，表明STPK-CCR3 基因表達(dá)被抑制后在一定程度上提高了感病小麥植株的抗病性.

3.3 TaSTPK-CCR3參與小麥-白粉菌互作過(guò)程

在小麥抗白粉病的研究中， 已鑒定出多個(gè)白粉病的抗性基因.本研究在感病小麥京411 中，對(duì)STPKCCR3 基因在白粉菌誘導(dǎo)下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因受誘導(dǎo)后呈下調(diào)表達(dá)模式，且應(yīng)答迅速，推測(cè)其很可能與小麥白粉病的發(fā)生機(jī)制相關(guān).葉春秀等[20]克隆了甜瓜蛋白激酶類基因CmPKC 的全長(zhǎng)序列，通過(guò)對(duì)抗、 感病材料中CmPKC 的相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)的分析，推測(cè)CmPKC 基因可能與感病及開(kāi)花、生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)， 屬于早期應(yīng)答基因.本研究在小麥中克隆的STPK-CCR3 與上述PKC 具有類似的結(jié)構(gòu)域，屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，降低該基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)白粉菌孢子的萌發(fā)受到抑制，菌絲生長(zhǎng)緩慢，與已報(bào)道的研究結(jié)果一致[9-10].結(jié)合qPCR 結(jié)果，初步推斷STPK-CCR3基因很可能參與小麥-白粉菌早期互作過(guò)程.本研究對(duì)STPK-CCR3 基因的功能分析為小麥分子育種提供了新的基因資源.