余斯琦，朱長軍

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 天津 300387； 2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點實驗室， 天津 300387；3.天津師范大學(xué) 分子細胞系統(tǒng)生物學(xué)重點實驗室，天津 300387）

轉(zhuǎn)錄因子C-jun 基因作為原癌基因， 在多種癌變器官中呈現(xiàn)高表達，如肺癌、宮頸癌、乳腺癌[1-4]等.C-jun 在子宮內(nèi)膜癌中的表達量也較高， 并且能夠與類固醇生成因子1 和肝臟受體同源物1 結(jié)合促進子宮內(nèi)膜癌的增殖.研究[5-6]表明，C-jun 的表達水平與患者臨床病理特征和預(yù)后密切相關(guān)， 預(yù)示著C-jun 可作為腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要指標(biāo).

C-jun 全長331 個氨基酸，包括兩大功能域：轉(zhuǎn)錄因子激活功能域和亮氨酸拉鏈bZIP 功能域（含DNA結(jié)合功能域）， 屬于Jun 家族蛋白.Jun 家族成員主要包括 C-Jun、Jun B 和 Jun D.Jun 家族可與 Fos 家族（包括 C-Fos、Fos B、Fra1 和 Fra2）通過亮氨酸拉鏈 bZIP 結(jié)構(gòu)組成二聚體，其中最為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄因子二聚體AP-1就是由C-jun 和C-Fos 聚合而成[1].C-jun 在細胞中參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等重要生理過程[7]，它主要通過行使自身的轉(zhuǎn)錄功能來調(diào)控多種蛋白的表達，進而完成對細胞生理過程的調(diào)節(jié).當(dāng)它發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能時，C-jun 氨基端激酶（JNK）對 C-jun 的 N 端進行磷酸化，使其能夠二聚化形成同型或異型二聚體[1]，并增強其二聚體的穩(wěn)定性，進而促進轉(zhuǎn)錄[8].C-jun 在細胞中能夠轉(zhuǎn)錄 WT1[9-10]、Keratin 5[11-12]、Id2A[13-14]等多種與細胞生理活動相關(guān)的蛋白.其中，C-jun 通過轉(zhuǎn)錄WT1，使得WT1 在有絲分裂時期與MAD2、BUBR1 等結(jié)合，從而抑制細胞有絲分裂后期促進復(fù)合物APC（anaphase promoting complex）對 Cyclin B1 的降解作用[10].因此，C-jun 對于細胞的正常生長分裂具有重要意義.

C-jun 作為一個重要的轉(zhuǎn)錄因子， 其下游靶基因已見文獻報導(dǎo)，這些基因都參與細胞分化[15]、增殖[10]、凋亡[16]等重要生命過程.本研究通過細胞轉(zhuǎn)染、點突變、藥物篩選等方法，獲得Flag-C-jun 和Flag-C-junmut穩(wěn)定表達的HelaS 細胞株， 并用蛋白印記雜交和細胞免疫熒光染色方法對細胞株進行驗證，為進一步篩選轉(zhuǎn)錄因子C-jun 的下游靶基因， 研究其調(diào)控細胞生命活動的作用機制奠定實驗基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒和細胞

pFlag-c-jun 表達質(zhì)粒， 購于優(yōu)寶生物公司；HelaS細胞，由天津師范大學(xué)分子細胞系統(tǒng)生物學(xué)重點實驗室提供.

1.1.2 主要試劑和工具酶

Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶），美國 Vazyme 公司；BamH1、Xho1 限制性內(nèi)切酶、轉(zhuǎn)染試劑Turbofect，美國Thermo Scientific 公司；瓊脂糖（REGULAR AGAROSE G-10），法國 BIOWESTE 公司； Gelred，美國 Biotium 公司；DMEM 細胞培養(yǎng)基，以色列Biological Industries 公司；FBS，美國HyClone 公司；G418，北京索萊寶科技有限公司；Opti-MEM 培養(yǎng)基，美國 Gibico 公司；Super DNA Marker，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 Flag-C-jun DNA 結(jié)合功能域缺失突變體質(zhì)粒的引物序列設(shè)計

以NCBI 上提供的C-jun cDNA 參考序列（NM_002228）作為模板，根據(jù)其DNA 結(jié)合功能域位置設(shè)計點突變PCR 引物，引物序列如表1 所示，引物由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司合成.

表1 pFlag-C-jun DNA 結(jié)合功能域缺失突變體質(zhì)粒引物設(shè)計Tab.1 Primer design of pFlag-C-jun DNA binding domain deletion mutant

1.2.2 點突變

以pFlag-c-jun 質(zhì)粒為模板，加入Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶、dNTP、 引物、buffer 進行 PCR 擴增.PCR 擴增程序如下：95 ℃ 30 s 預(yù)變性，95 ℃ 30 s 變性，64 ℃ 1 min 退火，72 ℃ 7 min 延伸，16 個循環(huán)；72 ℃10 min 終延伸，4 ℃保存.得到的PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，驗證無雜帶后用Dpn I 酶切1 h（水浴37 ℃），再次 DNA 電泳驗證無誤后，將 PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞進行擴增， 所得質(zhì)粒送至生物公司測序，驗證無誤后獲得突變體質(zhì)粒.

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

用含 10%FBS 的 DMEM 培養(yǎng) HelaS 細胞.將HelaS 細胞接種于24 孔板中，每孔3×104個細胞，24 h后將配制好的轉(zhuǎn)染試劑（每孔含質(zhì)粒250 ng、Turbofect 0.5 μL、Opti-MEM 100 μL） 邊搖邊加至 24 孔板中，放入細胞培養(yǎng)箱（CO2體積分?jǐn)?shù)為5%， 37 ℃）中培養(yǎng)24～48 h.

1.2.4 穩(wěn)篩細胞株的構(gòu)建

將HelaS 細胞接種于24 孔板中，每孔細胞數(shù)量為3×104個，鋪4 個孔.其中，空白對照和轉(zhuǎn)染pFlag-c-jun或pFlag-c-junmut質(zhì)粒各2 個孔，48 h 后從空白對照和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞中各取一孔做Western blot， 測定Flag-C-jun 蛋白表達.將另一孔中的細胞（對照細胞和轉(zhuǎn)染后的細胞） 用胰酶消化后轉(zhuǎn)至10 cm 平板使細胞分散開，用含有750 ng/μL G418 的 DMEM 進行培養(yǎng).5 d 后換液， 直至細胞形成單克隆.挑取細胞克隆至24 孔板進行培養(yǎng).細胞正常生長后，取1/2 細胞進行Western blot 檢測是否有 Flag-C-jun 或 Flag-C-junmut的表達，將能夠表達Flag-C-jun 或Flag-C-junmut的細胞轉(zhuǎn)至10 cm 平板進行正常細胞傳代培養(yǎng).

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡雜交

用配制的SDS 裂解液收集細胞，得到全細胞裂解液后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，再通過半干型轉(zhuǎn)印電泳槽將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜1 h.脫脂奶粉封閉 0.5 h，一抗室溫孵育 2 h（M α tubulin，RT 2 h；M α Flag，RT 2 h），TBST 洗 3 次，二抗室溫孵育 1 h（G α mouse HRP），加入 ECL 和過氧化氫后曝光.

1.2.6 細胞免疫熒光染色

細胞計數(shù)后，在細胞爬片上每孔鋪3×104個細胞，待密度大約為80%～90%時取出爬片，PBS洗3次，用甲醇-丙酮固定液固定5 min，再次用PBS 清洗3 次.用山羊血清配成的封閉液封閉0.5 h，用0.1% PBS-TX洗3 次.加入0.1% PBS-TX 稀釋的一抗稀釋液， 室溫孵育 2 h（M α Flag，RT 2h）.PBS-TX 洗 3次，加入0.1% PBS-TX 稀釋的二抗稀釋液， 室溫避光孵育1 h.二抗結(jié)束后， 加入 0.1% PBS-TX 稀釋的DAPI，0.1%PBS-TX 洗3 次后加入抗熒光猝滅劑， 用指甲油將細胞爬片的周圍密封，置于熒光顯微鏡下觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 真核細胞表達質(zhì)粒pFlag-c-jun的酶切鑒定

pFlag-c-jun 質(zhì)粒全長 6 445 bp，其中 c-jun 的 cD NA全長為996 bp.根據(jù)圖1 的質(zhì)粒圖譜可以看出，pFlag-c-jun 質(zhì)粒經(jīng)BamH1 和Xho1 雙酶切后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳能夠看到一條約為1 005 bp 的條帶，與目的基因的長度大致相符，同時還有一條長度約為5 440 bp 的條帶，與載體片段大小一致，因此酶切驗證該質(zhì)粒正確.

2.2 構(gòu)建Flag-c-jun DNA結(jié)合功能域缺失突變體質(zhì)粒pFlag-c-junmut

根據(jù)NCBI 上查找到的C-jun 的DNA 結(jié)合功能域（圖2），通過點突變的方式將該區(qū)域去除，瓊脂糖凝膠電泳驗證后（圖3），用獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌.將生長的單克隆細菌小量擴增后小提質(zhì)粒，送至生物公司測序.通過比對測序結(jié)果可以得知， 本研究已成功將C-jun DNA 結(jié)合功能域去除（圖4）.

圖1 質(zhì)粒pFlag-c-jun 的酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of plasmid of pFlag-c-jun

圖2 C-jun 的氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of C-jun

圖3 pFlag-c-junmut 點突變瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of pFlag-c-junmut point mutation

圖4 pFlag-c-junmut 點突變測序結(jié)果比對Fig.4 Alignment of pFlag-c-jun and pFlag-c-junmut sequences

2.3 Flag-C-jun和Flag-C-junmut穩(wěn)定表達細胞株的構(gòu)建

成功得到真核細胞表達質(zhì)粒pFlag-c-jun 和pFlag-c-junmut后， 構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達 Flag-C-jun 和Flag-C-junmut的穩(wěn)篩細胞株.分別轉(zhuǎn)染pFlag-c-jun 和pFlag-c-junmut質(zhì)粒，48 h 后收集細胞進行 Western blot，結(jié)果如圖5 所示.由圖5 可以看出，2 個質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染48 h 后均有表達.隨后用含有G418 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，挑取單克隆移至24 孔板后， 收集部分細胞進行蛋白表達檢測， 以瞬時轉(zhuǎn)染的pFlag-c-jun 和pFlag-c-junmut作為對照， 直至選出能夠穩(wěn)定表達Flag-C-jun 和Flag-C-junmut的細胞株.由圖6 可以看出， 轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pFlag-c-jun 的細胞中，1 號細胞株能夠穩(wěn)定表達Flag-C-jun.由圖7 可以看出， 轉(zhuǎn)染了pFlag-c-junmut的細胞中，2 號細胞株能夠穩(wěn)定表達Flag-C-junmut.隨后對2個篩選出來的細胞株進行免疫熒光染色， 結(jié)果如圖8所示.由圖8 可以看出， 細胞中有Flag-C-jun 和Flag-C-junmut的穩(wěn)定表達，且均在細胞核內(nèi).

圖5 pFlag-c-jun 和pFlag-c-junmut 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Western blot 結(jié)果Fig.5 Western blot results of transfection of pFlag-c-jun or pFlag-c-junmut

圖6 Flag-C-jun 穩(wěn)定表達細胞株的構(gòu)建Fig.6 Congstruction of Flag-C-jun cell lines

圖7 Flag-C-junmut穩(wěn)定表達細胞株的構(gòu)建Fig.7 Construction of Flag-C-junmut cell lines

圖8 Flag-C-jun 和Flag-C-junmut 穩(wěn)定表達細胞株的免疫熒光染色Fig.8 Immunofluorescence staining of Flag-C-jun and Flag-C-junmut stable expressed cell lines

3 討論

C-jun 是一種轉(zhuǎn)錄因子，同時也是促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的下游關(guān)鍵成員之一.C-jun 參與調(diào)節(jié)多種細胞功能，包括細胞增殖、存活、分化、對紫外線輻射的反應(yīng)、免疫反應(yīng)和炎癥等.C-jun可以幫助乙酰轉(zhuǎn)移酶募集到RUNX2 啟動子，進而完成對組蛋白3 特定位點的乙?；龠MRUNX2 的轉(zhuǎn)錄[17]；NMB（Neuromedin B）促進 C-jun 磷酸化，能夠誘導(dǎo)COX-2 和 IL-6 的表達上調(diào)[18]；C-jun 是激活 AXL 的必不可少的轉(zhuǎn)錄因子， 促進與耐藥相關(guān)的STC2-JUNAXL-ERK 通路[19]；C-jun 還參與 p53 的負調(diào)控，通過抑制p53 的表達降低p21 的積累，使得細胞周期能夠順利進行[20].

由于C-jun 在多個生理過程中都發(fā)揮著重要作用，因此作為一個轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄底物的研究非常重要.本研究通過點突變的方法，將C-jun 序列中的DNA結(jié)合功能域切除， 使C-jun 無法形成二聚體與DNA 結(jié)合.在此基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達Flag-C-jun和Flag-C-junmut的細胞株.這些細胞株的構(gòu)建有助于進一步通過ChIP 實驗研究轉(zhuǎn)錄因子C-jun 的下游關(guān)鍵靶基因， 為更加清晰深入地認(rèn)識C-jun 的生物學(xué)功能提供實驗基礎(chǔ).