趙羿耿佳熊文羽張亞娟趙秋棱彭衛(wèi)華包中偉譚博盧宇程靜卜楓嘯袁慧軍*

1西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(重慶400715)

2陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心(重慶400038)

耳聾是臨床上最常見的感覺神經(jīng)系統(tǒng)缺陷疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界超過(guò)5%的人口——4.66億人患有不同程度的聽力損失，基因缺陷、機(jī)體老化、病毒和細(xì)菌感染、藥物引起的耳毒性、外傷、暴露于噪音環(huán)境等都是聽力損失發(fā)生的病因，其中約60%由遺傳性因素導(dǎo)致。遺傳性耳聾根據(jù)其是否伴有其他器官異常，可分為綜合征型耳聾（syndromic hearing loss，SHL）和非綜合征型耳聾（non-syndromic hearing loss，NSHL）兩類。非綜合征型耳聾根據(jù)遺傳模式的不同可分為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、性染色體連鎖遺傳和線粒體母系遺傳。目前遺傳性耳聾網(wǎng)站（hereditaryhearingloss.org）已收錄遺傳性非綜合征型耳聾基因119個(gè)，常顯耳聾基因47個(gè)，常隱耳聾基因76個(gè)，X連鎖遺傳基因5個(gè)。本研究我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)涉及四代人的耳聾家系，通過(guò)二代測(cè)序證實(shí)該家系耳聾患者中存在2種致病基因——POU4F3基因和PDZD7基因。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于耳聾基因診斷具有重要提示作用，同一家系或同一耳聾患者可能存在多種致病基因。隨著TGE+MPS模式的廣泛使用及全外顯子組測(cè)序（Whole Exome Sequencing，WES）和全基因組測(cè)序（Whole Genome Sequencing，WGS）的成本降低，更高通量的耳聾基因測(cè)序技術(shù)可以為聾兒家庭提供完整準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷指導(dǎo)和專業(yè)遺傳咨詢服務(wù)[1]。

1 資料與方法

1.1 家系資料的采集

本家系由西南醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心采集，并通過(guò)西南醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)證。該家系來(lái)自河南省，編號(hào)HL-258。采樣小組對(duì)先證者及其各親屬成員進(jìn)行了家系調(diào)查，參與研究的家系成員均簽署知情同意書，對(duì)家系成員進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查、聽力學(xué)檢查、視覺系統(tǒng)檢查、體格檢査等。采集各家系成員外周血5ml，提取DNA并-80°C凍存。

1.2 測(cè)序及變異位點(diǎn)致病性分析流程

使用課題組自主設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域捕獲試劑盒HHL-785進(jìn)行檢測(cè)，該試劑盒覆蓋目前已知耳聾基因及文獻(xiàn)報(bào)道與聽覺系統(tǒng)相關(guān)基因共785個(gè)。目標(biāo)區(qū)域涵蓋了785個(gè)基因的外顯子、外顯子上下游50bp及線粒體DNA序列。以GRCh37/hg19為參考序列，測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)應(yīng)用BWA軟件進(jìn)行原始讀長(zhǎng)定位，Picard工具進(jìn)行質(zhì)控和去重操作，使用GATK和VEP工具進(jìn)行變異識(shí)別和注釋，最小等位基因頻率（Minor allele frequency,MAF）按0.5%進(jìn)行變異過(guò)濾，過(guò)濾后變異應(yīng)用SIFT、Polyphen-2、LRT和MutationTaster等工具進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)，應(yīng)用PhyloP、GERP++工具進(jìn)行保守性分析。

1.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

針對(duì)檢出的POU4F3基因和PDZD7基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物，對(duì)已采集樣本的家系成員進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控后，通過(guò)Mutation-Surveyor軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析檢出變異是否符合家系內(nèi)聽力表型和基因型共分離。

1.4 保守性及蛋白三維結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用ClustalX-2.1對(duì)POU4F3和PDZD7在不同物種中的保守性進(jìn)行分析。應(yīng)用Swiss-model（https://swissmodel.expasy.org）工具進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬，使用PyMoL軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)可視化。

2 結(jié)果

2.1 HL-258家系資料及聽力學(xué)特征

HL-258家系通過(guò)回訪可追溯至4代人，存在耳聾患者5人，參與該研究家系成員共4人。先證者父母Ⅲ-2、Ⅲ-3為非近親結(jié)婚，自家人回憶：在先證者Ⅳ-2幼兒期懷疑其存在聽力下降情況，但一直未引起足夠重視。先證者Ⅳ-2自述9歲時(shí)感知到聽力下降，11歲測(cè)聽雙耳中度感音神經(jīng)性耳聾，全頻下降，顳骨CT未見明顯異常。先證者父母Ⅲ-2、Ⅲ-3聽力正常。Ⅱ-3患者自述30多歲時(shí)感到聽力下降，71歲測(cè)聽雙耳重度感音神經(jīng)性耳聾，全頻進(jìn)展性下降。上述四人視覺系統(tǒng)正常，未訴視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)相關(guān)癥狀，身體其他系統(tǒng)未見異常，無(wú)噪音史及耳毒性藥物用藥史。

圖1 HL-258家系圖及聽力曲線Fig.1 Pedigree diagram and audiograms of HL-258

2.2 致病基因鑒定

對(duì)Ⅱ-3和Ⅳ-2進(jìn)行測(cè)序分析，下機(jī)數(shù)據(jù)通過(guò)質(zhì)控和去重后，使用GATK和VEP進(jìn)行變異識(shí)別和注釋。以MAF值＜0.5%進(jìn)行變異位點(diǎn)過(guò)濾后，共得到43個(gè)候選變異，其中包括4個(gè)已報(bào)道的良性變異。根據(jù)聽力表型、VEP Impact注釋得分等條件進(jìn)行篩查后得到兩個(gè)候選基因變異，Ⅱ-3：POU4F3:NM_002700.3:c.976A＞G(p.Arg326Gly)雜合變異，Ⅳ-2：PDZD7：NM_024895.4:c.490C＞T(p.Arg164Trp)純合變異。POU4F3基因該變異為首次報(bào)道，該變異gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)人群頻率為0。致病性預(yù)測(cè)軟件SIFT、Polyphen-2、LRT和 MutationTaster預(yù)測(cè)皆為有害突變，GERP++和PhyloP預(yù)測(cè)都為保守性位點(diǎn)。Kim等人在2013年報(bào)道了一個(gè)POU4F3基因韓國(guó)大家系，通過(guò)連鎖分析鑒定出致病突變POU4F3:c.977G＞A(p.Arg326Lys)，與本研究Ⅱ-3檢出變異為相同氨基酸殘基的不同改變[2]。本文PDZD7基因檢出變異于2019年9月被韓國(guó)學(xué)者首次報(bào)道，文章共報(bào)道兩個(gè)家系患者與Ⅳ-2具有相同致病突變，聽力嚴(yán)重程度與本文情況相似[3]。該變異gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)東亞人群頻率0.5‰，在3752個(gè)正常對(duì)照中未檢出。SIFT、Polyphen-2、LRT和MutationTaster預(yù)測(cè)為有害突變，GERP++和PhyloP預(yù)測(cè)為非保守性位點(diǎn)。

2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明，Ⅱ-3 POU4F3、PDZD7基因雜合突變，Ⅳ-2 PDZD7基因純合突變，Ⅲ-2、Ⅲ-3 PDZD7基因雜合突變，Ⅳ-2 、Ⅲ-2、Ⅲ-3三人POU4F3基因?yàn)橐吧?，結(jié)合患者Ⅱ-3及Ⅳ-2的聽力表型，兩基因突變符合基因型與表型共分離，POU4F3、PDZD7基因即為該家系耳聾患者致病基因。該四代耳聾家系存在兩種遺傳模式，Ⅱ-3一代為常染色體顯性遺傳。Ⅲ-2由于POU4F3基因?yàn)橐吧?，POU4F3基因突變?cè)谠摷蚁滴催z傳給下一代。Ⅳ-2 PDZD7基因純合突變遺傳自父母雙方，為常染色體隱性遺傳模式。

圖2 POU4F3、PDZD7 Sanger測(cè)序圖譜Fig.2 Sanger sequencing chromatograms of the POU4F3 and PDZD7

2.4 保守性及蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬分析

將POU4F3氨基酸序列在不同物種中進(jìn)行比對(duì)，Arg326在各物種中高度保守。以2xsd（PDB ID）為模板構(gòu)建Arg326Gly突變型蛋白進(jìn)行分析，Arg326位于POU4F3蛋白POU同源結(jié)構(gòu)域的核定位信號(hào)（nuclear localization signals，NLSs）上，極性正電荷精氨酸突變?yōu)闃O性不帶電荷的甘氨酸后，使Arg326和Pro297之間喪失相互作用，從一定程度上改變了局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，可能會(huì)影響POU4F3蛋白亞細(xì)胞定位[4,5]。PDZD7 Arg164在不同物種中高度保守，以2EEH（PDB ID）為模板構(gòu)建PDZD7突變型蛋白發(fā)現(xiàn)，該變異位于PDZD7蛋白第一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域末端，極性精氨酸突變?yōu)榉菢O性色氨酸后，局部疏水作用發(fā)生改變，使Arg164與Asp82之間產(chǎn)生相互作用，影響局部二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

圖3 突變位點(diǎn)保守性分析及蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬分析。A：POU4F3蛋白Arg326保守性分析；B：POU4F3蛋白野生型&突變型結(jié)構(gòu)比較；C：PDZD7蛋白Arg164保守性分析；D：PDZD7蛋白野生型&突變型結(jié)構(gòu)比較；Fig.3 Conservation and three dimensional structure simulation analysis of the two missense mutations.A:Conservation analysis of the POU4F3 protein;B:Three dimensional structure comparison of wild-type and missense mutant in the POU4F3 protein;C:Conservation analysis of the PDZD7 protein;D:Three dimensional structure comparison of wild-type and missense mutant in the PDZD7 protein

3 討論

本研究，我們報(bào)道了一個(gè)具有耳聾家族史的四代家系，不同患者之間聽力表型存在明顯差異，我們通過(guò)二代高通量測(cè)序在該家系中鑒定出兩個(gè)致病基因突 變 位 點(diǎn) POU4F3：NM_002700.3:c.976A＞G(p.Arg326Gly)和 PDZD7：NM_024895.4:c.490C＞T(p.Arg164Trp)。Sanger測(cè)序驗(yàn)證兩突變符合基因型與表型共分離，保守性和蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬分析提示兩突變干擾蛋白局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響蛋白正常生理功能。

根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南分析，Ⅱ-3聽力情況符合 POU4F3致聾表型（PP4）,POU4F3:c.976A＞G(p.Arg326Gly)在人群數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率＜0.5%（PM2），多種方法預(yù)測(cè)為致病性變異（PP3），與已知致病性變異POU4F3:NM_002700.3:c.977G＞A(p.Arg326Lys)為相同氨基酸殘基的不同堿基改變（PM5），但由于無(wú)法獲取患者Ⅱ-3父母及其患病兄弟的臨床資料，故將此變異定義為“可能的疑似致病突變”。本文PDZD7：NM_024895.4:c.490C＞T(p.Arg164Trp)變異于2019年9月被韓國(guó)學(xué)者首次報(bào)道，文章報(bào)道了2個(gè)家系與本文患者Ⅳ-2擁有相同的PDZD7純合突變，患者均表現(xiàn)為語(yǔ)前中度感音神經(jīng)性耳聾，在KRGDB（Korean Reference Genome Database）該變異位點(diǎn)頻率為0.3%，作者認(rèn)為PDZD7:p.Arg164Trp為韓國(guó)人群高頻突變熱點(diǎn)，具有奠基者效應(yīng)（founder effect），根據(jù)ACMG指南將該變異位點(diǎn)定義為“可能致病”[3]。本文患者Ⅳ-2同樣為中度感音神經(jīng)性耳聾，但發(fā)病年齡晚于韓國(guó)病例，推測(cè)可能是由于患者之間不同遺傳背景的修飾作用所致。

POU4F3基因?yàn)镻OU轉(zhuǎn)錄因子IV類家族成員，位于染色體5q31，編碼338個(gè)氨基酸，包含POU特異性結(jié)構(gòu)域（POU specific domain）和POU同源結(jié)構(gòu)域（POU homeodomain）。POU4F3基因?yàn)镈FNA15型耳聾致病基因，于1998年Vahava等人在一個(gè)五代以色列耳聾大家系中鑒定出來(lái)[6]，主要臨床表型為雙側(cè)對(duì)稱遲發(fā)性中-重度進(jìn)行性感音神經(jīng)性耳聾。青少年至中年均可發(fā)病，全頻受損，聽力曲線多為平坦型或緩降型。在小鼠中，Pou4f3蛋白主要在內(nèi)耳毛細(xì)胞和前庭毛細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)。Pou4f3-/-小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的聽力損傷和前庭功能異常[7]。目前共報(bào)道29個(gè)POU4F3致病突變，除以色列（1）、巴西（1）、荷蘭（2）外，其余25個(gè)致病突變皆為東亞國(guó)家——中國(guó)（9），日本（13），韓國(guó)（3）。Kitano等人認(rèn)為POU4F3基因（2.5%，15/602）成為日本常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾（ADNSHL）第三大致病基因，僅次于KCNQ4基因（6.6%）和TECTA基因（2.9%）[8]。He等認(rèn)為POU4F3基因突變也是中國(guó)漢族人ADNSHL較為常見的原因[9]。

PDZD7基因位于染色體10q24.3，編碼含有PDZ結(jié)構(gòu)域的支架蛋白。PDZD7基因共3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，完整的PDZD7蛋白由三個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域、一個(gè)HNL結(jié)構(gòu)域（harmonin-N-like domain）和一個(gè)富含脯氨酸區(qū)域（proline-rich region）組成。在內(nèi)耳中可以檢測(cè)到包含前兩個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域的較短的PDZD7亞型。PDZD7蛋白在內(nèi)耳中定位于毛細(xì)胞機(jī)械敏感結(jié)構(gòu)的踝連接（ankle-link）處與其他USH相關(guān)蛋白USH2A，GPR98和WHRN形成USH四元復(fù)合物[10,11]。2009年，PDZD7基因在一個(gè)德國(guó)家庭中被確認(rèn)為非綜合征型耳聾DFNB57的致病基因[12]，主要臨床表型為語(yǔ)前中-重度非進(jìn)展性感音神經(jīng)性耳聾，聽力曲線多為平坦型或緩降型。PDZD7基因不僅是DFNB57的致病基因，也被認(rèn)為與Usher綜合征2型相關(guān)。Usher綜合征2型表現(xiàn)為中重度感音神經(jīng)性耳聾，RP表型約20歲左右出現(xiàn)。Ebermann等認(rèn)為GPR98和PDZD7雙基因突變可引起Usher綜合征2型發(fā)病，PDZD7基因突變與RP發(fā)病相關(guān)。USH2A基因純合突變患者攜帶PDZD7移碼突變會(huì)造成RP表型更加嚴(yán)重且發(fā)病時(shí)間更早[13]。通過(guò)ABR評(píng)估，Pdzd7-/-KO純合小鼠表現(xiàn)出先天性極重度耳聾，視網(wǎng)膜電圖顯示1月齡小鼠視錐、視桿細(xì)胞正常。免疫熒光觀察到耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞纖毛束紊亂，影響了與USH2A，GPR98和WHRN組成的USH四元復(fù)合物在內(nèi)耳中的定位[14]。本研究患者Ⅳ-2 PDZD7基因純合突變，無(wú)RP表型，由于患者目前還未到20歲，RP表型還應(yīng)繼續(xù)隨訪。

在本研究中，我們報(bào)道了一個(gè)具有耳聾家族史的四代家系，使用二代高通量測(cè)序鑒定出兩種致病變異，擴(kuò)展了POU4F3基因和PDZD7基因耳聾致病突變譜。在遺傳性耳聾家系致病基因鑒定過(guò)程中，同一家系檢出多種致病基因的情況并不罕見。2014年，本課題組對(duì)江西上饒的一個(gè)四代耳聾大家系進(jìn)行致病性分析，該家系遺傳方式復(fù)雜且患者之間聽力表型存在差異，通過(guò)高通量測(cè)序在不同患者中鑒定出3種致病基因——線粒體12S rRNA A1555G、CDH23和SLC26A4[15]。我們建議在具有耳聾家族史的同一家系中，如果遺傳方式復(fù)雜且患者之間聽力表型存在明顯差異，應(yīng)考慮家系是否可能存在多基因致病的情況，并推薦使用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行更多耳聾致病基因檢測(cè)和診斷，以提高致病基因檢出率，減少漏診。隨著近年來(lái)TGE+MPS模式的廣泛應(yīng)用和WES、WGS成本的降低，使得致病基因快速篩查和更多耳聾新基因的發(fā)現(xiàn)成為可能，從而為耳聾家庭生育后代時(shí)提供更加專業(yè)的遺傳咨詢和生育指導(dǎo)，降低聾兒出生率，減輕家庭及社會(huì)的負(fù)擔(dān)。