樊瓊玲，劉 濤，俞金秀，馬正文，張石蕾，由淑萍

(新疆醫(yī)科大學(xué) 1.護(hù)理學(xué)院，2. 公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

心肌肥厚是一種為維持心輸出量和保證組織灌流的適應(yīng)性反應(yīng)，壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)[1]。研究表明[2]，心肌肥厚的逆轉(zhuǎn)可以降低心血管疾病的死亡率。肉蓯蓉(Cistance)素有“沙漠人參”之美譽(yù)。苯乙醇總苷(Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhGs)是肉蓯蓉發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[3]，具有抗癡呆、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、緩解疲勞、抗腦缺血/再灌注損傷等多種藥理作用[4]。研究顯示[5]，CPhGs可以抑制因缺血再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡并發(fā)揮保護(hù)心肌組織的作用。然而，肉蓯蓉CPhGs能否對(duì)壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚能起到抑制作用，尚不可知。因此，本研究通過構(gòu)建大鼠腹主動(dòng)脈縮窄(abdominal aorta coarctation，AAC)模型，探討CPhGs對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚的作用，以及對(duì)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B，PI3K/PKB)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以研究CPhGs抑制壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研發(fā)對(duì)心肌肥厚防控的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SPF級(jí)大鼠，70只，體質(zhì)量(200±20)g,由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)與合格證號(hào)分別為：SYXK(新)2016-0003，SCXK(新)2016-0002。

1.2 藥物與試劑肉蓯蓉苯乙醇總苷CPhGs(和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司，批號(hào)：20180502)，纈沙坦(北京諾華制藥有限公司,規(guī)格：80 mg)，0.5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)(西安正天藥用輔料有限公司)，戊巴比妥鈉(德國Meck公司)，RIPA(美國Thermo公司),p-PI3K、PI3K、p-PKB、PKB、β-actin兔抗單克隆抗體、大鼠血漿內(nèi)皮素1(endothelin 1, ET-1)和腦利鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(北京博奧森公司)，辣根過氧化酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋公司)，蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑混合物、BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶公司)，ECL顯色液(中國Biosharp公司)、PVDF膜(英國Roche公司)。

1.3 主要儀器飛利浦HD11 XE超聲診斷儀(德國Philips公司)；移液器(德國Eppendorf公司)；低溫離心機(jī)(美國Sigma公司)；全波長自動(dòng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測儀((美國Thermo公司)；電泳和轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司)；FluorChem E 化學(xué)發(fā)光高靈敏凝膠成像儀(美國Protein Simple公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、模型制備及給藥根據(jù)文獻(xiàn)[6]采用AAC術(shù)制備大鼠壓力超負(fù)荷心肌肥厚模型。雄性SD大鼠70只，隨機(jī)分為7組：空白組(Control, Con)、假手術(shù)組(Sham)、模型組(Mod)、纈沙坦陽性藥對(duì)照組(Valsartan, Vst)、CPhGs 125、250、250 mg·kg-1組，涉及藥物劑量參照文獻(xiàn)[7-8]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置。Con組不進(jìn)行手術(shù)，Sham組分離腹主動(dòng)脈不予結(jié)扎，其余五組建立壓力超負(fù)荷心肌肥厚模型。術(shù)后d 3，CPhGs各劑量組及Vst組(10 mg·kg-1)按每天設(shè)定劑量灌胃給予受試物，其余3組均灌胃給予相同體積的0.5%CMC-Na，連續(xù)42 d，每日1次；d 43，以2.5%戊巴比妥鈉麻醉后，行心臟超聲檢查，開腹采取腹主動(dòng)脈血處死大鼠，立即開胸，取出心臟。

2.2 大鼠心臟超聲指標(biāo)的檢測在2.5%戊巴比妥鈉麻醉下，剃毛后，使用超聲診斷儀檢測各組大鼠的心功能指標(biāo)：(1)左心室舒張末期后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPWT)(2)左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)(3)左心室短軸收縮率(left ventricular fractional shortening，LVFS)(4)左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fractions，LVEF)。每只大鼠重復(fù)3次測量后，計(jì)算平均值。

2.3 大鼠心臟體質(zhì)量指數(shù)(heart weight/body weight index, HWI)計(jì)算大鼠結(jié)束心臟超聲學(xué)檢測后，打開腹腔，腹主動(dòng)脈取血至大鼠死亡后，立即開胸，取出大鼠心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗心腔3次，用干凈的濾紙吸干水分，稱心臟質(zhì)量(heart weight, HW)。HWI=HW/體質(zhì)量(body weight，BW)。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測大鼠血漿ET-1和BNP水平腹主動(dòng)脈血液儲(chǔ)存于EDTA抗凝采血管，混勻后3 000 r·min-1離心15min，收集上清，-20 ℃條件下凍存。按試劑盒說明書操作。

2.5 顯微鏡觀察大鼠心肌組織病理學(xué)改變大鼠心肌組織以4%多聚甲醛固定、石蠟包埋后，經(jīng)伊紅蘇木素染色后以中性樹膠封片，電子顯微鏡下觀察心肌組織和細(xì)胞形態(tài)并拍圖。用Image J測量細(xì)胞表面積，每組選取四張標(biāo)本，每張隨機(jī)選取3個(gè)視野，每視野測量10～15個(gè)心肌細(xì)胞面積(area of myocardial cells，AMC)，計(jì)算平均值。

2.6 Western blot 檢測p-PI3K, PI3K, p-PKB, PKB蛋白的表達(dá)稱取心肌組織50mg,加入液氮研磨充分后加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑混合物，提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量至60 μg，加入4×Loading buffer后在100 ℃下熱變性5 min，上樣到10%聚丙烯酰胺凝膠，120 V電泳60 min，200 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min，PVDF膜濕轉(zhuǎn)。5%脫脂奶粉室溫下封閉 PVDF膜1 h，1×TBST緩沖液置于搖床振蕩清洗10 min，3次，加入相應(yīng)比例稀釋的一抗(目的基因p-PI3K, PI3K, p-PKB, PKB為1 ∶1 000，內(nèi)參β-actin為1 ∶20 000)，4 ℃下孵育過夜，清洗3次后室溫下孵育二抗1 h。FluorChem E 化學(xué)發(fā)光高靈敏凝膠成像儀拍照顯色，分析條帶灰度值。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值×100%

3 結(jié)果

3.1 CPhGs對(duì)壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠的心臟超聲指標(biāo)的影響Tab 1可見，與Con組和Sham組相比，Mod組的LVPWT顯著增加，LVEDD、LVEF、LVFS顯著減小(P<0.01)；與Mod組相比， Vst組和CPhGs 125、250、500 mg·kg-1組大鼠的LVPWT減少，LVEDD、LVEF、LVFS增加，CPhGs組隨著劑量的增加呈現(xiàn)改變逐漸明顯的趨勢，Vst組及CPhGs 250、500 mg·kg-1組作用顯著(P<0.05或P<0.01)；與Vst組相比， CPhGs 250、500 mg·kg-1組各指標(biāo)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明中、高劑量的CPhGs對(duì)壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠有保護(hù)作用，其作用與陽性藥物相當(dāng)。

3.2 CPhGs對(duì)壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠的HWI的影響Tab 2可見，各組大鼠的BW沒有明顯差異；與Con組和Sham組相比，Mod組大鼠的HW和HWI顯著相加(P<0.01)；與Mod組相比，Vst組HW和HWI顯著減小(P<0.01),CPhGs 125、250、500 mg·kg-1組(P<0.05或0.01)HW和HWI有不同程度的減小，且隨著劑量的增加呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢；與Vst組相比，CPhGs 500 mg·kg-1組與其接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明中、高劑量CPhGs可以減小壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠的心肌肥厚程度，保護(hù)心肌，與Vst作用相當(dāng)。

Tab 1 Effect of CPhGs on echocardiography in rats with myocardial hypertrophy induced by pressure

**P<0.01vsCon and Sham;#P<0.05,##P<0.01vsMod;▲P<0.05vsVst

Tab 2 Effect of CPhGs on HWI in rats with myocardial hypertrophy induced by pressure

**P<0.01vsCon and Sham;#P<0.05,##P<0.01vsMod;▲P<0.05vsVst

3.3 CPhGs對(duì)壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠血漿BNP和ET-1水平的影響Tab 3可見，與Con組和Sham組相比，Mod組大鼠的血漿BNP和ET-1水平顯著上升(P<0.01)；與Mod組相比，Vst組大鼠的血漿BNP和ET-1水平顯著下降(P<0.01)，CPhGs 125、250、500 mg·kg-1組血漿BNP和ET-1水平有不同程度下降，并且隨著劑量的增加呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，其中CPhGs 250組BNP顯著下降(P<0.01)、500 mg·kg-1組BNP和ET-1均顯著下降(P<0.01)；與Vst組相比，CPhGs 500 mg·kg-1組BNP和ET-1水平降低，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明250、500 mg·kg-1中、高劑量的CPhGs可以降低壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠的血漿BNP和ET-1水平，高劑量組作用強(qiáng)度與Vst相當(dāng)。

Tab 3 Effect of CPhGs on BNP and ET-1 in plasma of ratswith myocardial hypertrophy

**P<0.01vsCon and Sham;##P<0.01vsMod;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsVst

3.4 心肌組織病理學(xué)觀察結(jié)果Fig 1 和Fig 2可見，與Con組和Sham組相比，Mod組心肌細(xì)胞排列紊亂，組織中可見炎性細(xì)胞浸潤，單位視野內(nèi)細(xì)胞核的數(shù)量減少，AMC顯著增大(P<0.01)；與Mod組相比，Vst組單位視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量增加，AMC顯著減小(P<0.01)，CPhGs 125、250、500 mg·kg-1組的AMC也有不同程度減小，并且隨著劑量的增加呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢,其中CPhGs 250、500 mg·kg-1組較Mod組有明顯差異(P<0.05或0.01)；與Vst組相比，CPhGs 500 mg·kg-1組AMC與其接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明中、高劑量CPhGs在一定程度有減小壓力超負(fù)荷型心肌肥厚大鼠AMC的作用，當(dāng)劑量達(dá)500 mg·kg-1作用與Vst接近。

3.5 CPhGs對(duì)壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠心肌組織PI3K/PKB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 3和Fig 4可見，與Con組和Sham組相比，Mod組p-PI3K、p-PKB蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；與Mod組相比，Vst組p-PI3K、p-PKB蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，CPhGs 125、250、500 mg·kg-1組有不同程度升高，隨著劑量的增加, p-PI3K、p-PKB蛋白相對(duì)表達(dá)量呈逐步增加趨勢,其中CPhGs 250、500 mg·kg-1組較Mod組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與Vst組相比，CPhGs 500 mg·kg-1組p-PI3K、p-PKB蛋白的相對(duì)表達(dá)量與其接近，無明顯差異。表明中、高劑量CPhGs能夠增加壓力負(fù)荷型心肌肥厚大鼠心肌組織的p-PI3K、p-PKB蛋白的相對(duì)表達(dá)量，高劑量組與Vst的作用相當(dāng)。

Fig1PictureofmyocardialtissueswithHEstaining(×400,n=4)
A:Con;B:Sham;C:Mod;D:Vst;E:CPhGs 125 mg·kg-1;F:CPhGs 250 mg·kg-1;G:CPhGs 500 mg·kg-1

Fig 2 Effect of CPhGs on AMC in rats with myocardial hypertrophy induced by pressure

**P<0.01vsCon and Sham;#P<0.05,##P<0.01vsMod;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsVst

4 討論

心肌肥厚作為高血壓的主要并發(fā)癥之一，同時(shí)也參與了慢性心衰、冠心病等心血管疾病的病理過程。在高血壓前期，心肌通過增加心室壁張力從而適應(yīng)增加的壓力負(fù)荷，心肌細(xì)胞代償性增大，導(dǎo)致左室心肌肥厚。心肌肥厚的抑制可以降低心血管疾病發(fā)病率及總死亡率，其作用優(yōu)于單純降壓治療[9]。因此，高血壓的治療方案不應(yīng)局限于血壓的控制能夠增加壓力負(fù)荷型心肌肥厚大鼠，逆轉(zhuǎn)心肌肥厚是治療高血壓的亟待解決的問題。

Fig 3 Representative Western blot bands of p-PI3K, PI3K, p-PKB, PKB and β-actin(n=3)

Fig 4 Effect of CPhGs on expression of p-PI3K and p-PKB in rats with myocardial hypertrophy

**P<0.01vsCon and Sham;##P<0.01vsMod;▲▲P<0.01vsVst

肉蓯蓉被列為管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa Wight干燥帶鱗葉肉質(zhì)莖。近年來，肉蓯蓉以其顯著的生物活性備受人們的關(guān)注，國內(nèi)學(xué)者對(duì)肉蓯蓉的心血管等方面的藥理作用進(jìn)行了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉對(duì)心肌具有一定保護(hù)作用，但其具體的分子作用機(jī)制仍不清楚。研究表明[10]，CPhGs能減輕自由基對(duì)心肌線粒體膜和漿網(wǎng)膜造成的損傷，降低丙二醛含量，減輕心肌超微結(jié)構(gòu)損傷，提高大鼠心肌線粒體抗氧化酶活性，減少心肌梗死面積，提高心肌組織磷酸肌酸激酶活性，對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CPhGs可減小心肌肥厚大鼠的LVPWT、HWI、AMC及心肌肥厚標(biāo)志物ET-1、BNP水平，同時(shí)增加LVEDD、EF、FS，而抑制心肌肥厚，改善大鼠的心功能。隨藥物濃度增加，CPhGs作用效果增加，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，其中CPhGs 中高劑量組肌肥厚大鼠有明顯的保護(hù)作用，高劑量組與纈沙坦陽性藥組作用相當(dāng)。

PI3K是心肌細(xì)胞肥大和由收縮型向肥厚型轉(zhuǎn)換的最后通路[11]，PI3K的2種亞型可參與心肌細(xì)胞肥大，其中pll0α參與生理性心肌肥厚，而p110γ參與病理性心肌肥厚，小鼠敲除p110γ后，對(duì)心肌病理性刺激可產(chǎn)生保護(hù)作用，對(duì)于心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生、發(fā)展起著至關(guān)重要的作用[12]。PKB途徑與心肌細(xì)胞增殖、生長、代謝、凋亡等多種生物學(xué)活動(dòng)密切相關(guān)[13]。葉芳杏等[14]報(bào)道玉郎傘單體17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮可以通過調(diào)控心肌內(nèi)皮細(xì)胞的p-PI3K、p-PKB、p-eNOS等蛋白逆轉(zhuǎn)大鼠壓力超負(fù)荷心室的重構(gòu)。楊洋等[15]報(bào)道，綠原酸可通過PI3K/PKB通路調(diào)控細(xì)胞凋亡，抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。本研究中,CPhGs中、高劑量組顯著增加p-PI3K、p-PKB蛋白相對(duì)表達(dá)量，且CPhGs高劑量組與Vst組作用相當(dāng)，進(jìn)一步證明CPhGs可以通過激活PI3K/PKB信號(hào)通路，抑制壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚。

綜上，本研究證實(shí)CPhGs對(duì)AAC術(shù)后壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠有保護(hù)作用，可能與其增加PI3K、PKB磷酸化而激活PI3K/PKB信號(hào)通路有關(guān)。這為臨床研究高血壓心肌肥厚提供了新思路，可能為高血壓心肌肥厚的防控和逆轉(zhuǎn)提供了新的治療藥物。