張亞楠，焦仁剛，趙貴，陳錫龍，黃鑫，欒慶祥，章厲劼，彭珊，徐景峨，蒲齡，余波

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽550005；2.貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽550003）

0 引 言

食源性致病菌是引起人類健康和食品安全的主要因素之一，而微生物污染是導(dǎo)致牛奶質(zhì)量問題的重要因素，因此牛奶中的致病菌成為消費者關(guān)注的焦點。而我國對原料奶的質(zhì)量要求遠低于乳業(yè)發(fā)達國家。我國乳品新國標中僅規(guī)定了生奶中細菌的最低檢出總數(shù)（少于2×106個/mL），未對牛奶中具體的細菌種類進行規(guī)定，這忽視了對病原菌的檢測[1]。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌則是牛奶源主要的致病菌，這些食源性致病菌嚴重影響著人和動物的健康[2-4]。因此，需要快捷、靈敏的方法對牛奶中食源性致病菌進行檢測。

多重PCR（multiplex PCR，mPCR）方法可同時檢測多種病原體，且具有特異性強、靈敏度高、檢測時間短和檢測成本低等特點，適合大量臨床樣本（特別是混合感染樣本）中病原體的快速檢測[5]。本研究根據(jù)金黃色葡萄球菌femB 基因序列、大腸桿菌phoA 基因序列和沙門氏菌invA 基因序列，分別設(shè)計3 對特異性引物，建立一種能夠同時快速檢測牛奶中3 種食源性致病菌的多重PCR 方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌ATCC?25922標準株、沙門氏菌ATCC?13076 標準株、金黃色葡萄球菌ATCC?6538 標準株、牛結(jié)核桿菌、多殺性巴氏桿菌、牛支原體，均由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室保存。單核細胞增生李斯特氏菌ATCC?7644、志賀氏菌ATCC?8700 購自上海北諾生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；DL2000 DNA Marker、500bp DNA Lad?der(Dye Plus)、Premix Taq(EX Taq version 2.0 plus dye)等購自寶生物（大連）工程有限公司；LB 液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等均購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

參考GenBank 中的金黃色葡萄球菌femB 基因序列（檢索號：GQ284649.1）、大腸桿菌phoA 基因序列（檢索號：NC_011750.1）和沙門氏菌invA 基因序列（檢索號：M90846.1），經(jīng)比對分析后，采用Primer Premier 5.0 分別設(shè)計各基因的特異性引物，引物的序列與目的片段大小見表1。

表1 引物信息

1.4 細菌DNA 的提取

將-80 ℃保存的菌株分別接種于相應(yīng)的營養(yǎng)肉湯復(fù)蘇，劃線于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，200 rpm 搖床中培養(yǎng)12 h。參照細菌基因組提取試劑盒說明書進行提取細菌DNA，將提取的DNA 模板于-20 ℃保存。

1.5 單一PCR 擴增及產(chǎn)物鑒定

單一PCR 反應(yīng)采用25 μL 反應(yīng)體系：Premix Taq(EX Taq version 2.0 plus dye)12.5 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 加至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，擴增30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μLPCR 擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，陽性產(chǎn)物送往生工生物工程股份有限公司進行測序分析。測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/上進行Blast分析，以確認目的基因。

1.6 多重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

對多重PCR 反應(yīng)條件，包括退火溫度（50～60 ℃）和引物濃度（5～20 μmol/L）進行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)條件，同時以雙蒸水作為空白對照。多重PCR 反應(yīng)在50 μL 反應(yīng)體系中進行：Premix Taq(EX Taq version 2.0 plus dye)25 μL，3 種細菌DNA 混合模板2 μL，3 對上、下游引物各1 μL，ddH2O 加至50μL。反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，50～60 ℃35 s，72 ℃45 s，擴增30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR 擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.7 敏感性試驗

將1.5 測序比對無誤的DNA 片段連到PUC57 載體（2 710 bp）上，構(gòu)建同時攜帶三個基因的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌工程菌DH5α 中，在加入IPTG、X-Gal的LB 培養(yǎng)基上挑選白色菌落，經(jīng)PCR 鑒定篩選出陽性菌株保存。提取陽性菌株的質(zhì)粒，用蛋白質(zhì)核酸儀測定濃度后，經(jīng)10 倍梯度稀釋后作為單一PCR 反應(yīng)和多重PCR 反應(yīng)的模板，用優(yōu)化后的PCR 反應(yīng)程序進行擴增，以檢測該方法的敏感性。

1.8 特異性試驗

以混合核酸（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌）、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、牛結(jié)核桿菌、多殺性巴氏桿菌、牛支原體、單核細胞增生李斯特氏菌、志賀氏菌的核酸為模板分別進行多重PCR 反應(yīng)，以鑒定該方法的特異性。

1.9 重復(fù)性試驗

用建立的多重PCR 方法，多次重復(fù)檢測金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌及3 種細菌的混合陽性樣本，以驗證多重PCR 的穩(wěn)定性。

1.10 多重PCR 對臨床樣品的檢測

將臨床采集的未經(jīng)巴氏殺菌的25 份鮮牛奶樣品（生乳），參照GB19301-2010 測定生乳中微生物菌落總數(shù)。同時，將樣品簡單增菌（樣品∶增菌液=1∶25）后采用細菌基因組提取試劑盒進行提取細菌DNA，進行多重PCR 和單一PCR 擴增。

參照GB27342-2009 將25 份鮮牛奶樣品經(jīng)63～65 ℃、30 min 殺菌處理得到巴氏殺菌乳，參照國標GB4789.3平板計數(shù)法、GB4789.10定性檢驗、GB4789.4分別對大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌進行檢測。同時，經(jīng)簡單增菌后提取細菌DNA，進行多重PCR 和單一PCR 檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一PCR 擴增及產(chǎn)物的鑒定

單一PCR 結(jié)果表明，擴增片段分別為各細菌的特異性條帶。測序結(jié)果證實金黃色葡萄球菌femB 的大小為233 bp，大腸桿菌的phoA 的大小為444 bp，沙門氏菌invA 的大小為724 bp，均與預(yù)期大小相符。經(jīng)比對分析，結(jié)果顯示各細菌基因測序結(jié)果與NCBI 上公布序列同源性達100%（見圖1）。

2.2 多重PCR 反應(yīng)方法的建立及條件的優(yōu)化

通過對退火溫度和引物濃度等條件進行優(yōu)化，確定多重PCR 反應(yīng)在50 μL 反應(yīng)體系中的最佳反應(yīng)條件為，退火溫度52 ℃，引物濃度10 μmol/L，最佳反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，52 ℃35 s，72 ℃45 s，擴增30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。各細菌的特異性引物均有效擴增出了其目的片段，分別為724 bp(沙門氏菌)，444 bp(大腸桿菌)、233 bp(金黃色葡萄球菌)，引物間無非特異性片段產(chǎn)生（見圖2）。

2.3 敏感性試驗

圖1 各基因同源性對比

圖2 沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄菌多重PCR

經(jīng)PCR 鑒定，本研究成功構(gòu)建同時攜帶三個基因的陽性質(zhì)粒，大小為4 111 bp（見圖3）。在優(yōu)化的多重PCR 反應(yīng)條件中，該多重PCR 對細菌的最低檢測量分別為沙門氏菌133.3 pg/mL、大腸桿菌13.3 pg/mL、金黃色葡萄球菌13.3 pg/mL（見圖4）。在單一PCR 反應(yīng)中，各細菌的最低檢測量分別為沙門氏菌0.013 pg/mL、大腸桿菌1.33 pg/mL、金黃色葡萄球菌13.3 pg/mL（見圖5、6、7）。

2.4 特異性試驗

在特異性試驗中，對混合DNA（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌）、沙門氏菌DNA、大腸桿菌DNA、金黃色葡萄球菌DNA均擴增出了相應(yīng)的目的片段，而對其他菌株的DNA未見擴增產(chǎn)物，表明該多重PCR具有較好的特異性（見圖8及圖4中11～14孔）。

圖3 陽性質(zhì)粒的多重PCR鑒定

圖4 多重PCR敏感性與特異性試驗

圖5 沙門氏菌單一PCR敏感性試驗

圖6 大腸桿菌單一PCR敏感性試驗

圖7 金黃色葡萄球菌單一PCR敏感性試驗

圖8 多重PCR特異性試驗

2.5 重復(fù)性試驗

用建立的多重PCR 方法，多次重復(fù)檢測金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌及3 種細菌的混合陽性樣本，均能擴增出相應(yīng)的目的條帶，表明該多重PCR方法具有較好的重復(fù)性（見圖9）。

2.6 臨床應(yīng)用

25 份未經(jīng)巴氏殺菌的鮮牛奶樣品（即生乳）中微生物菌落總數(shù)均小于2×106，符合食品安全國家標準生乳中微生物限量的規(guī)定；而多重PCR 檢測結(jié)果顯示（見表2），19 份大腸桿菌陽性，2 份沙門氏菌+大腸桿菌雙陽性，1 份大腸桿菌+金黃色葡萄球菌雙陽性，這與單一PCR 檢測結(jié)果一致，且與細菌分離鑒定結(jié)果一致。多重PCR 和單一PCR 對25 份巴氏殺菌乳經(jīng)簡單增菌后提取的細菌DNA 進行檢測，結(jié)果無陽性檢出。同時依照巴氏殺菌乳國家標準對大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌進行傳統(tǒng)細菌分離鑒定，結(jié)果均為陰性。

3 討 論

近些年，食品安全問題頻發(fā)，而細菌性食物中毒則是其重要問題之一。目前，國內(nèi)主要采用傳統(tǒng)的細菌分離鑒定方法檢測食品中的病原菌，其操作繁瑣、檢測周期較長，且混合感染嚴重導(dǎo)致其方法的靈敏度較低[6]。因此，建立一種快速、有效、靈敏的檢測方法是很有必要的。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌是引起牛奶微生物污染的主要致病菌。本研究建立的多重PCR 反應(yīng)方法可以對臨床牛奶樣本中的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌單獨或混合感染進行快速、準確的檢測及鑒定。結(jié)果表明，該診斷方法檢測時間短、敏感性好、特異性高，具有廣闊的應(yīng)用前景。

多重PCR 反應(yīng)體系中存在多對引物和多個模板，相互之間發(fā)生作用的機率很大，很容易導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)[7]。因此，多重PCR 的引物設(shè)計至關(guān)重要，應(yīng)該選擇各自相對保守的基因序列作為靶基因。本研究中所用引物參考GenBank 中金黃色葡萄菌femB 基因序列高度保守，是金黃色葡萄菌區(qū)別于其他葡萄球菌的一個特異性染色體標志基因[8-9]，同時femB 基因與細菌細胞壁的合成有關(guān)，它也是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性的輔助基因[10-11]。而大腸桿菌堿性磷酸酶phoA基因，是普遍存在于所有的大腸桿菌中的持家基因，具有良好的特異性，它編碼的酶能催化非特異性磷酸單酯水解，對機體內(nèi)磷代謝的調(diào)節(jié)有重要作用，還可以作為信號酶被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)疾病檢測、免疫學(xué)和分析生物技術(shù)[12-14]。沙門氏菌invA 基因是沙門氏菌的一種侵襲蛋白基因，其編碼的蛋白決定沙門氏菌對腸粘膜細胞的侵襲力，是致病性沙門氏菌存在的最直接標志[15-16]。本研究根據(jù)以上3 種保守基因序列，擴增片段分別為233 bp、444 bp、724 bp，片段大小級差在200 bp 以上，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后易于分開，有很高的辨識度，在實際應(yīng)用中不易造成誤判。

影響多重PCR 成功的因素有很多，其中退火溫度會直接影響引物與模板DNA 的結(jié)合效率，還會導(dǎo)致PCR 反應(yīng)的非特異性擴增[17]。研究表明，多重PCR 反應(yīng)體系的退火溫度要比單一PCR 擴增時的退火溫度低4 ℃左右[18]。同時，所有引物對的最適退火溫度要盡可能的相同，這有助于在多重PCR 反應(yīng)中每對引物都有相同的擴增效率[19]。本研究中的三對引物在單一PCR 反應(yīng)中退火溫度為55 ℃時，均能保證很高的擴增效率；通過條件優(yōu)化，多重PCR 反應(yīng)在退火溫度為52 ℃時效果最優(yōu)。

表2 臨床應(yīng)用

同時，本研究構(gòu)建了同時攜帶femB、phoA、invA 三個基因的質(zhì)粒，作為陽性菌株模板。這種方法可獲得大量穩(wěn)定的陽性模板DNA，且保證三個基因的拷貝數(shù)準確一致，有利于開展檢測方法的敏感性試驗，也為后續(xù)臨床樣品的檢測提供穩(wěn)定、準確的陽性對照。

本研究還表明，巴氏殺菌法能有效地將牛奶中的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌這3 種致病菌殺死，但致病菌產(chǎn)生的毒素蛋白的活性是否已經(jīng)全部失活還有待我們進一步地探究。同時，生乳中存在的耐藥菌株產(chǎn)生的滅活酶，如β-內(nèi)酰胺酶等蛋白的活性及安全性風(fēng)險也有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究建立的多重PCR 反應(yīng)方法可以快速、準確地對臨床牛奶樣本中的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌單獨或混合感染進行檢測。同時構(gòu)建攜帶femB、phoA、invA 三個基因的陽性質(zhì)粒，為臨床檢測提供穩(wěn)定、準確的陽性對照，具有廣闊的應(yīng)用前景。