朱秀清 ，王 嬋，孫禹凡，鐘明明，齊寶坤

（1.東北農業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，哈爾濱 150076；3.哈爾濱市食品產業(yè)研究院，哈爾濱 150028）

人造食品通常以膠體形式存在，如乳液、泡沫、凝膠和分散體等。乳液是兩種不混溶液體混合物，一種分散于另一液體中[1]；可通過酸誘導、鹽誘導、熱誘導等方法使乳液形成一種軟固體材料，通常稱為乳液凝膠，包括傳統(tǒng)制造食品奶酪、酸奶、冰淇淋、甜點、涂抹醬和加工肉等[2]。乳液凝膠基于乳液遞送系統(tǒng)，調整凝膠組成、尺寸、形狀和內部結構，在食品界備受關注。

大豆分離蛋白（Soybean protein isolate，SPI）是重要植物蛋白產品，具有重要營養(yǎng)作用和功能特性，應用廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，單一SPI在功能上無法滿足食品加工需要，油脂、蛋白質、糖為重要營養(yǎng)物質[3]，影響食品穩(wěn)定性和質構，通過向SPI 中添加某種特殊成分可改善SPI特殊功能。

多糖與蛋白結合可提高食品乳液及凝膠穩(wěn)定性，中性及陰性多糖穩(wěn)定效果優(yōu)于陽性多糖[4]，本文選用陰性和中性多糖與SPI 相互作用。研究復合物形成乳液及乳液凝膠穩(wěn)定性。瓜爾豆膠是中性多糖，在食品工業(yè)中發(fā)揮穩(wěn)定劑和增稠劑作用，與蛋白可通過氫鍵作用相互結合。Santos 等利用馬鈴薯蛋白為原料，瓜爾豆膠為穩(wěn)定劑，制備瓜爾豆膠-馬鈴薯蛋白乳液，發(fā)現(xiàn)乳液穩(wěn)定性提高[5]?？ɡz是陰離子多糖，廣泛應用于食品中，可作為增稠劑、膠凝劑、穩(wěn)定劑及脂肪替代品等[6]。

近年蛋白-多糖復合物研究廣泛，其中瓜爾豆膠和卡拉膠研究較多，但比較兩種多糖對SPI乳液及乳液凝膠穩(wěn)定性的影響研究甚少。本文比較兩種多糖對SPI 乳液穩(wěn)定性的影響，通過CaCl2誘導形成乳液凝膠，觀察多糖種類及濃度對乳液凝膠基本性質影響，為制備具有高穩(wěn)定性遞送系統(tǒng)及低脂肪軟固體食品替代物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓜爾豆膠，購自天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠；卡拉膠，購自天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠；亞麻籽油，購自北京金世倉糧油貿易有限公司；CaCl2，購自天津市光復精細化工研究所；磷酸氫二鈉，購自北京新光化工試劑廠；磷酸二氫鈉，購自北京新光化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ULTRA-TURRAX UTL 2000 高壓均質機，購自上海標本模型有限公司；LGR20-W 臺式高速冷凍離心機，購自北京京立離心機有限公司；Mastersizer 2000 激光粒度儀，購自英國馬爾文儀器有限公司；購自UV-5100 型高性能紫外可見分光光度計， 購自上海奧析科學儀器；MAGNA-IR 560傅里葉變換紅外光譜儀，購自美國NICOLET 儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI提取

通過堿溶酸沉方法提取大豆分離蛋白[7]。將大豆磨粉后過80 目篩，將所得豆粉與正己烷以料液比1：3（m/V）比例混合，常溫下攪拌1 h 脫脂3 次，將脫脂豆粉按料液比為1：10（m/V）加入去離子水，1 mol·L-1NaOH 溶液調豆粉溶液pH 為8.5，以9 000 g 離心30 min 去除其中不溶性物質。取上清液用2 mol·L-1HCl溶液調pH為4.5，再9 000 g離心30 min，蛋白質處于等電點狀態(tài)而凝聚沉淀。取離心沉淀物，加5倍去離子水，調節(jié)pH為7.0，水洗離心（9 000 g、30 min）2 次，棄上清液，將沉淀物冷凍干燥得到SPI。

1.3.2 SPI-多糖乳液制備

將適量SPI分散在磷酸鹽緩沖液（0.02 mol·L-1，pH 7.0）中，室溫下攪拌2 h 以確保蛋白質完全溶解。將SPI（最終濃度為5%，W/V）溶液分別加入卡拉膠、瓜爾豆膠（最終濃度為0、0.05%、0.1%、0.2%和0.3%，W/V）溶液中，邊滴邊利用磁力攪拌，形成復合物攪拌30 min后，加入10%（V/V）亞麻籽油，1 100 r·min-1條件下均質3 min，80 MPa下高壓均質，制備不同乳液，4 ℃條件貯藏。

1.3.3 SPI-多糖乳液凝膠制備

在1.3.1基礎上，向乳液中加入1 mol·L-1CaCl2分散液，使CaCl2濃度達到35 mmol·L-1，攪拌均勻后將其放入60 ℃水浴鍋中加熱30 min，取出后即于冰水浴中冷卻至室溫，將新鮮制備乳液凝膠4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 動態(tài)光散射

應用Mastersizer 2000 儀器測量蛋白質顆粒尺寸分布（d4,3）和ζ-電位。根據(jù)Khales 等[8]方法略有改動。將制備不同帶電荷多糖乳液分散到0.02 mol·L-1，pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，樣品稀釋至0.1 wt%，在室溫下測量3次，計算平均值和標準偏差。分散體（SPI）使用1.450 折射率，連續(xù)相使用1.331折射率[9]。

1.3.5 微觀結構

采用激光共聚焦（CLSM）觀察乳液微觀結構，采用Okuro[10]方法略有改動。分別稱取一定量尼羅藍和尼羅紅溶于異丙醇中，充分溶解最終濃度分別為1%和0.1%，將制備尼羅紅和尼羅藍過濾膜，過去殘渣。準確吸取上述制備新鮮乳液200 μL，稀釋5 倍，加入25 μL 尼羅藍和20 μL 尼羅紅，充分混勻，30 min 后制片，全程避光。樣品染色以后，置于表面皿上，放置在激光共聚焦顯微鏡后，采用10倍目鏡和60倍物鏡，552和488 nm波長下與相應燃料對應，觀察拍照。

1.3.6 乳化活性、乳化穩(wěn)定性

根據(jù)Zhang 等[11]方法略改動，測定乳化活性（Emulsion activity index， EAI）及 乳 化 穩(wěn) 定 性（Emulsion stability index，ESI）取上述1.3.2 新鮮制備乳狀液40 μL，8 mL 0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS）溶液稀釋40 倍，漩渦振蕩器使其充分混勻。以0.1%SDS 為空白，使用紫外分光光度計在500 nm波長下測量吸光值，記為A0；靜置30 min 后再次在500 nm 波長下測量吸光值，記為A30乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）測量公式如下：

式中，EAI為單位質量乳液乳化表面積（m2·g-1）；N為稀釋倍數(shù)（200）；C 為乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質質量濃度（g·mL-1）；φ為乳化液中油相體積分數(shù)0.1；A0為0 min時吸光值；A30為30 min時吸光值。

1.3.7 紅外光譜（FTIR）分析

采用程志先和Bekale等[12]方法稍作修改。將多糖與SPI復合物直接冷凍干燥，冷凍干燥后樣品置于干燥器中用P2O5充分干燥，取樣品1.5 與200 mg溴化鉀研磨混勻后壓片測定紅外光譜。為減少水蒸汽影響干擾，用干燥N2持續(xù)注入測量室。測定時波數(shù)為4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)64，分辨率4 cm-1，得到紅外吸收曲線采用Peak fitting 軟件和高斯曲線擬合，分析蛋白在不同多糖添加量下二級結構含量變化。

1.3.8 凝膠作用力分析

根據(jù)Tang等[13]方法，略有改動，分析添加不同多糖處理后形成SPI-多糖乳液凝膠作用力。配置4種緩沖溶液分別為：A（離子水）；B（pH 8.0 Tris-Gly 緩沖液）；C（B+2% SDS）；D（C+1%β-ME）；稱取2 g 乳液凝膠樣品分別置于30 mL 上述4種緩沖溶液中，4 ℃環(huán)境下攪拌1 h，將分散液在4 800 g離心力下離心15 min，取上層乳狀液經相應緩沖液稀釋，600 nm 下測量吸光值，計算濁度值。乳液濁度值計算公式：

式中，T 為每cm 濁度；A 為600 nm 下吸光度；D是稀釋倍數(shù)；L是容器路徑長度（cm）。

1.3.9 質構

按照Zhao 等[14]描述方法并在此基礎上略有改動，將1.3.3 所制備乳液凝膠在4 ℃冰箱內儲藏過夜，取出放在室溫（25 ℃）下平衡至少30 min，利用TA-XT Plus質構儀測定SPI乳狀液凝膠硬度、彈性等。探頭為P/0.5，側前速度5 mm·s-1，測定速度1 mm·s-1，測后速度5 mm·s-1，觸發(fā)力為5 g，測定距離為凝膠高度1/2。

1.3.10 持水性

乳液凝膠持水性測定根據(jù)Boutin等[15]方法適當修改。取上述制備乳液凝膠樣品約20 g，放置于50 mL 離心管中，在4 ℃、10 000 g 條件下離心15 min，離心后將離心管倒置30 min，使析出水分充分釋放，用濾紙小心將釋放水分析出后稱量。持水率為離心后凝膠中水分含量與離心前總水分含量百分比，計算公式如下：

式中，WHC：持水率；W1：離心析出水后凝膠與離心管總重量；W2：離心前凝膠樣品與離心管總重量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均為3 個平行樣平均值，采用SPSS 22.0分析軟件和Origin 8.0軟件處理，ANOVA分析數(shù)據(jù)差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 動態(tài)光散射

不同多糖種類及濃度經相同均質壓力與SPI相互作用形成乳液平均粒徑d4,3變化趨勢如表1所示，未添加多糖形成乳液d4,3值一般分布在300 nm，而添加多糖乳液隨多糖類型及添加量不同，d4,3均呈增大趨勢，電位絕對值不同。當多糖添加量較?。ā?.1%）時，在相同多糖添加量下，乳液d4,3表現(xiàn)為陰離子多糖乳液＜中性多糖乳液，即SPI-卡拉膠乳液＜SPI-瓜爾豆膠乳液，在多糖添加量為0.1%時，形成穩(wěn)定復合物，d4,3增加量相對于其他增加量較小，電位絕對值最大，證明在多糖添加量為0.1%時形成乳液最穩(wěn)定，優(yōu)于空白組。當多糖添加量較高（＞0.1%）時，在相同多糖添加量下乳液d4,3表現(xiàn)為SPI-卡拉膠乳液＜SPI-瓜爾豆膠乳液，電位絕對值隨多糖濃度添加降低。由于卡拉膠是陰離子多糖，加入帶負電荷SPI 乳狀液中二者相互排斥，導致電位絕對值明顯降低，d4,3略增加；瓜爾豆膠是中性多糖，加入帶負電荷SPI乳液中二者通過氫鍵及疏水相互作用結合，電位絕對值無明顯變化，d4,3增加；當添加多糖濃度比較高時，溶液粘度比較大，流動性較差，形成乳狀液具有更大粒徑。結果表明，當添加多糖濃度為0.1%時，乳液可達最穩(wěn)定狀態(tài)，陰離子多糖-卡拉膠形成乳液穩(wěn)定性優(yōu)于中性多糖-瓜爾豆膠所形成乳液。

表1 不同多糖及添加量下乳液動態(tài)光散射Table 1 Dynamic light scattering of emulsions with different addition rates of different polysaccharides and polysaccharide

2.2 乳液微觀結構分析

不同類型多糖及不同多糖添加量下形成乳液微觀結構見圖1?？梢姡斂ɡz濃度較低（≤0.1%）時，乳液分散狀態(tài)較好，粒徑較小較均勻；在卡拉膠添加量為0.1%時，乳液穩(wěn)定性最佳，由于陰離子多糖可通過靜電相互作用與SPI形成使系統(tǒng)和乳液更穩(wěn)定。由圖1 可知，當濃度超過0.2%、0.3%時粒徑明顯變大，與前文粒徑電位結果一致。瓜爾豆膠在不同濃度下形成的乳液，多糖添加量為0.1%時粒徑最小，濃度超過0.1%時，粒徑明顯變大。結果表明，多糖添加量為0.1%時，形成乳液相對較穩(wěn)定，卡拉膠穩(wěn)定乳液優(yōu)于瓜爾豆膠穩(wěn)定乳液。

2.3 乳化性分析

由圖2 可知，兩種多糖可改善乳液乳化特性。陰離子多糖卡拉膠-SPI 形成乳液，隨卡拉膠添加量增加EAI、ESI 呈現(xiàn)先增后降趨勢，在添加量為0.1%時達最高，這是因為在中性條件下，卡拉膠與SPI 帶正電荷部分結合形成SPI-卡拉膠復合物，吸附于界面，提高乳化性，一定濃度卡拉膠可增加體系黏稠度、增大界面膜厚度，防止乳粒聚集沉淀，提高其穩(wěn)定性，而卡拉膠添加量達0.2%、0.3%時，EAI、ESI 明顯下降說明卡拉膠濃度過高不利于乳液穩(wěn)定性，這是由于多糖與蛋白質在界面上競爭吸附作用較強，使界面蛋白吸附量減小，乳化性降低。中性多糖瓜爾豆膠-SPI 所形成乳液，隨瓜爾豆膠添加量增加EAI 呈先升后降趨勢，ESI呈先降后升趨勢。在添加量為0.1%時EAI達最大，因為隨多糖添加量變化可改變SPI二級結構含量，改善蛋白質乳化性，這與粒徑電位結論一致。

2.4 紅外光譜（FTIR）分析

通過紅外光譜表征不同多糖種類及添加量穩(wěn)定蛋白乳液中SPI 二級結構含量變化，利用Peak Fit擬合軟件分析計算圖譜（見圖3），得到不同多糖與SPI 形成乳液中SPI 二級結構含量變化如表2 所示。結果表明，相比未添加多糖SPI乳液，添加多糖后乳液中SPI β-折疊含量均增加，當多糖添加量較低（≤0.1%）時，β-折疊呈增加趨勢，α-螺旋、β-轉角及無規(guī)則卷曲呈減少趨勢；多糖添加量超過0.1%時，β-折疊、β-轉角及無規(guī)則卷曲含量均降低，α-螺旋含量升高，說明多糖添加改變SPI中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲4種二級結構含量，與對乳液穩(wěn)定性與蛋白結構改變關系預測結論一致?？ɡz與瓜爾豆膠添加量為0.1%時，β-折疊結構含量最高，高達56.1%和45.0%，其他含量變化不明顯，因此推測SPI二級結構改變可增加柔性結構，蛋白質分子由無序變?yōu)橛行?，改變SPI基本性質，提高乳化性及穩(wěn)定性。

表2 不同多糖乳液中蛋白二級結構含量Table 2 Secondary structure of proteins in different polysaccharide emulsions (%)

2.5 凝膠作用力分析

由圖4可見，不同種類乳液凝膠在B中溶解度比A 中溶解度高，而瓜爾豆膠-SPI 乳液凝膠溶解度比卡拉膠-SPI 乳液凝膠溶解小，但高于對照組。各樣品在C中溶解度高于B，說明疏水相互作用在維持凝膠結構中發(fā)揮作用；而添加多糖樣品在C和B中溶解度差值略大于空白組樣品，說明添加多糖促進SPI 乳液在形成凝膠過程中疏水鍵生成，各樣品在D中溶解度高于C，說明二硫鍵在凝膠結構中發(fā)揮作用。乳液凝膠在各緩沖溶液中溶解度差值證實多糖加入增強各種作用力，增加凝膠強度。

2.6 質構

不同多糖及多糖添加量對CaCl2誘導SPI乳液凝膠硬度及黏彈性的影響見表3。

表3 不同多糖及多糖添加量下乳液凝膠質構Table 3 Texture of emulsion gels with different polysaccharides and polysaccharides added

由表3可知，卡拉膠、瓜爾豆膠兩種多糖形成乳液凝膠硬度及黏彈性均差異明顯，由于多糖添加量不同所形成乳液凝膠表現(xiàn)不同質地特性，表明多糖濃度及類型對乳液凝膠影響較大。多糖添加量增加形成乳液凝膠黏度逐漸增大，瓜爾豆膠-SPI乳液凝膠更明顯；當多糖添加量0～0.1%時，制備乳液凝膠硬度和彈性呈增加趨勢，0.2%～0.3%在中性條件下，卡拉膠與SPI呈相互排斥狀態(tài)時，由于體系排阻作用使卡拉膠對大豆分離蛋白凝膠增效，加入卡拉膠固定大量水分，增濃大豆蛋白，促進凝膠形成，提高凝膠強度[3]，瓜爾豆膠可通過增加體系黏度發(fā)揮增稠作用提高凝膠硬度及彈性，但多糖超過某一濃度，因排斥作用而產生絮凝，導致凝膠硬度及彈性逐漸降低。Tang 等研究證明凝膠微觀結構影響凝膠硬度，當多糖添加量為0.1%時，凝膠具有最高硬度及彈性，可形成更聚集凝膠網(wǎng)絡，而多糖添加量超過0.1%時硬度及彈性呈相反趨勢[16]。因此，當多糖添加量為0.1%時乳液凝膠硬度及彈性具有最優(yōu)表現(xiàn)，陰離子多糖卡拉膠形成乳液凝膠結構性質更佳。

2.7 持水率

不同多糖及多糖添加量對CaCl2誘導SPI 乳液凝膠持水率影響見圖5。當多糖添加量0～0.1%時，乳液凝膠WHC隨多糖添加量增加而增加，多糖添加量0.1%時持水率達最高，這是因為多糖與SPI產生協(xié)同效應，混合乳液凝膠網(wǎng)絡結構穩(wěn)定，因此截留水量大；多糖添加量為0.1%～0.3%時，隨多糖添加量增加，形成乳液凝膠WHC降低，因為隨多糖含量增加降低混合凝膠強度，大分子熱力學活性和凝膠網(wǎng)絡微觀結構對WHC影響較大，高濃度生物聚合物非相容性誘導形成更多孔網(wǎng)絡，通過毛細管力具有較低持水能力，因此增加脫水能力，導致滲出網(wǎng)絡水分增加，此結論與Kuhun等[17]及任菲[18]研究結果相似。通過以上分析得出結論，當多糖添加量為0.1%時所形成乳液凝膠持水率最高，陰離子多糖作為穩(wěn)定劑優(yōu)于中性多糖。

3 結 論

當多糖添加量為0.1%時所形成SPI-多糖復合物乳液粒徑分布均勻穩(wěn)定，乳滴形狀規(guī)則，表現(xiàn)較好乳化活性和乳化穩(wěn)定性，形成乳液凝膠硬度、彈性及持水能力顯著（P＜0.05）增加。多糖添加改變SPI二級結構，提高乳化能力添加多糖為卡拉膠時SPI中β-折疊結構含量最高，影響蛋白質構象柔韌性，增加乳液穩(wěn)定性；當多糖添加量超過或低于0.1%時對乳液穩(wěn)定性及形成乳液凝膠宏觀結果造成不利影響。因此，本試驗結果表明，多糖添加量為0.1%時，形成乳液最穩(wěn)定最好，凝膠硬度、粘彈性及持水能力最高，陰離子多糖優(yōu)于中性多糖。