李永光，景 雅，孫銘陽，張沿政，萇興超，陳 龍，李文濱

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

大豆作為最重要的全球經(jīng)濟作物之一，多年來受鹽堿等逆境脅迫影響。高鹽可造成大豆植株滲透勢降低，水分吸收減少，營養(yǎng)元素吸收不平衡，進而導(dǎo)致離子毒害及次級氧化脅迫等[1]。因此，挖掘大豆中相關(guān)耐鹽功能基因，對于提高大豆植株耐鹽能力，增強大豆環(huán)境適應(yīng)性、提高大豆產(chǎn)量具有重要意義。

高鹽脅迫下，大豆植株地上部分鐵離子含量增高[2]。為平衡植物體在代謝調(diào)控期間鐵離子含量，液泡除含大量細胞代謝過程中的基本物質(zhì)，還可貯存并轉(zhuǎn)運鐵離子[3]。液泡鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白家族（Vacuolar iron transporters family）將鐵離子于液泡和細胞質(zhì)中相互轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)細胞中鐵離子含量[4]。當(dāng)細胞中鐵離子含量較高時，VITs可將鐵離子轉(zhuǎn)運至液泡中，保持胞內(nèi)離子含量盡量處于最佳生理范圍，維持細胞正常生長，防止細胞發(fā)生功能性障礙損傷[5]。

VITs 普遍存在于生物體內(nèi)，各成員間序列較為保守，相似度較高[6]。VITs 中首先被發(fā)現(xiàn)的是酵母CCC1（Ca2+-sensitive cross-complementer 1），該基因編碼的蛋白介導(dǎo)Fe2+和Mn2+進入液泡[7]。當(dāng)CCC1 在酵母中過表達，液泡中鐵離子濃度增加，在CCC1缺失的酵母ΔCCC1突變體中，液泡內(nèi)鐵離子濃度下降[8]。酵母CCC1 在擬南芥中的同源基因為AtVIT1，其編碼的蛋白與酵母CCC1 蛋白相似度高達58%[9]。AtVIT1 定位在液泡膜上，在維管束組織中高表達，且在胚胎和種子發(fā)育過程中大量表達[10]。AtVIT1在水稻中的兩個同源基因OsVIT1和OsVIT2 被證明可調(diào)控旗葉和種子之間的鐵離子轉(zhuǎn)運[11]。

前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，大豆GmVIT1 是被抗逆境轉(zhuǎn)錄因子NFYB調(diào)控的下游基因，對大豆抗逆境研究具有重要意義。GmVIT1 是VITs 家族成員，位于20 號染色體上，GmVIT1在擬南芥中的同源基因是AT3G43660。本研究利用熒光定量PCR技術(shù)分析GmVIT1在鹽脅迫及外源ABA誘導(dǎo)下的表達模式，分析轉(zhuǎn)基因毛狀根及轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性，發(fā)現(xiàn)GmVIT1可增強轉(zhuǎn)基因植株耐鹽能力。這一結(jié)果有助于進一步了解GmVIT1在大豆耐鹽響應(yīng)機制中的作用，為大豆分子育種深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆品種“墾豐16”由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供；引物合成及DNA 測序由華大基因公司完成；大腸桿菌感受態(tài)Trans-T1、T4連接酶、Trizol、cDNA第一鏈合成及熒光定量試劑盒購自天根生化公司；農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105 及K599 發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；高保真SF酶購自Vazyme 公司；CTAB 法提取DNA 所用藥品均購自AMRESCO公司。

1.2 GmVIT1生物學(xué)信息分析

Phtozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）查找GmVIT1ORF 及氨基酸序列；NCBI 預(yù)測GmVIT1保守結(jié)構(gòu)域并檢索同源基因，DNAMAN軟件比對氨基酸序列，MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3 GmVIT1克隆

在phytozome 數(shù)據(jù)庫中查找GmVIT1 轉(zhuǎn)錄本序列，利用Primer5.0 設(shè)計克隆引物（見表1）。Trizol法提取大豆墾豐16 葉片RNA，以反轉(zhuǎn)錄后cDNA文庫為模板，SF 高保真酶作PCR 擴增。膠回收目的條帶并與優(yōu)化后的pCXSN 表達載體T4連接。轉(zhuǎn)化Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)后挑取陽性克隆測序。

1.4 轉(zhuǎn)GmVIT1擬南芥篩選

提取重組質(zhì)粒pCXSN-GmVIT1 并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。選擇陽性菌株侵染擬南芥花序，獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株。在含5 mg·L-1PPTMS培養(yǎng)基中篩選T1代，并將陽性苗移入土中（土：蛭石=2：1）。待植株長至8～10 葉，CTAB 法提取葉片DNA 目的基因PCR鑒定（鑒定引物與克隆引物相同)并收獲，繼續(xù)繁殖至T3代植株。

1.5 GmVIT1 在不同處理及組織中的表達模式分析

1.5.1 高鹽及外源ABA處理

挑選墾豐16大豆種子播種于土壤，25 ℃（光周期為16 h/8 h）溫室培養(yǎng)。待第二個三出復(fù)葉完全展開，將植株根部洗凈并分別浸泡于含150 mmol·L-1NaCl 及100 μmol·L-1ABA 處理液中，以蒸餾水為對照。剪取150 mmol·L-1NaCl 和對照處理0、2、4、8、12、24和36 h葉片，剪取100 μmol·L-1ABA和對照處理0、4、6、12、24和48 h葉片，放入液氮速凍并迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱。提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，作熒光定量PCR。利用Primer 5.0 設(shè)計定量引物（見表1）。

表1 研究所用引物序列Table 1 Primers used in the study

1.5.2 組織特異性分析

播種后25 ℃（光周期為16 h/8 h）溫室培養(yǎng)。隨著大豆生長發(fā)育，剪取根、莖、葉、花、莢、種子放入液氮速凍并迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱。提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，作熒光定量PCR。

1.5.3 數(shù)據(jù)分析

每個試驗設(shè)置3 次生物重復(fù)，內(nèi)參基因為GmActin4，2-ΔΔCT計算基 因相對表達 量，GraphPad Prism 5分析顯著性并繪制柱形圖。

1.6 GmVIT1蛋白亞細胞定位分析

使用引物YFP-GmVIT1-F 及YFP-GmVIT1-R擴增獲得含有部分YFP 載體序列的GmVIT1，infusion 法將其構(gòu)建到Y(jié)FP 載體上獲得重組載體35S:YFP::GmVIT1，轉(zhuǎn)化Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)后挑取陽性克隆測序。通過PEG 轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒35S:YFP::GmVIT1 轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體中，22 ℃培養(yǎng)18 h，使用激光共聚焦顯微鏡觀察黃色熒光并分析定位情況。所需引物見表1。

1.7 轉(zhuǎn)GmVIT1大豆毛狀根的獲得及耐鹽性分析

將重組載體pCXSN-GmVIT1 及空載體pCXSN轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599 感受態(tài)細胞中，選擇陽性菌株誘導(dǎo)并鑒定大豆毛狀根。將長勢一致毛狀根置于含150 mmol·L-1NaCl蒸餾水中處理，以水處理為對照，25 ℃（光周期為16 h/8 h）培養(yǎng)7 d，觀察表型并記錄根長。所有表型均設(shè)置3 次重復(fù)，Graph Pad Prism 5分析顯著性，并繪制柱形圖。

1.8 轉(zhuǎn)GmVIT1擬南芥耐鹽性分析

將轉(zhuǎn)基因T3代種子和野生型經(jīng)10%次氯酸鈉滅菌處理后，種于含0、75、100及150 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基，24 ℃組培室培養(yǎng)，每天觀察并記錄轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥萌發(fā)及綠化情況。

種滅菌后轉(zhuǎn)基因T3代種子及野生型播種于MS培養(yǎng)基，24 ℃組培室培養(yǎng)5 d，將擬南芥幼苗移入含0、75、150及200 mmol·L-1NaCl MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)1周左右，觀察并測量轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥根長。

種滅菌后轉(zhuǎn)基因T3代種子及野生型播種于MS培養(yǎng)基，24 ℃組培室培養(yǎng)兩周，移擬南芥幼苗于土中（土：蛭石=2：1），1周后，隔天澆灌1次0.8 mol·L-1鹽水，處理1周，觀察并記錄轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥表型，隨后正常復(fù)水，觀察轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥恢復(fù)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmVIT1克隆及序列分析

根據(jù)phytozome數(shù)據(jù)庫查詢獲得GmVIT1轉(zhuǎn)錄本序列，提取大豆RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用GmVIT1的CDS全長引物作PCR擴增，得到1 073 bp單一條帶（見圖1）。經(jīng)測序確定從大豆墾豐16中克隆獲得GmVIT1 序列與數(shù)據(jù)庫一致，cDNA 序列全長660 bp，編碼219個氨基酸，蛋白比對結(jié)果表明GmVIT1 含有液泡鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白保守結(jié)構(gòu)域CCC1（見圖2）。

2.2 GmVIT1同源蛋白分析

在NCBI-BLAST 中比對GmVIT1 氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)野生大豆、木豆、綠豆等13 個物種中VIT 基因的氨基酸序列與GmVIT1 相似度較高。GmVIT1（Glycine max，XP_006606162.1）與野生大豆（Glycine soja，KHN17004.1）相似度高達92%；與木豆（Cajanuscajan，XP_020232118.1）相似度達87%；與綠豆（Vigna radiatevar，XP_014512558.1）相似度為88%，同源性相對最低的為擬南芥，相似度為72%。DNAMAN 多重比對結(jié)果與BLAST 結(jié)果一致，且均含有保守結(jié)構(gòu)域VIT1，體現(xiàn)VITs 家族序列保守性（見圖3）。

利用MEGA 7.0 將GmVIT1 氨基酸序列與以上13 個基因氨基酸序列整合生成系統(tǒng)進化樹（見圖4），結(jié)果表明，GmVIT1屬于VITs家族成員，與野生大豆親緣關(guān)系最近。

2.3 GmVIT1蛋白亞細胞定位

利用PEG 轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒35S:YFP::GmVIT1轉(zhuǎn)化至擬南芥原生質(zhì)體中，光照培養(yǎng)18 h，使用激光共聚焦顯微鏡觀察黃色熒光蛋白（見圖5）。結(jié)果顯示，在注射空載體的細胞中，黃色熒光在細胞各組分中均有分布，而注射重組載體35S:YFP::GmVIT1細胞中，黃色熒光僅分布在液泡膜上，表明GmVIT1為膜定位蛋白，定位在液泡膜上。

2.4 大豆GmVIT1表達模式分析

利用熒光定量分析GmVIT1 在大豆不同組織中的表達量（見圖6），結(jié)果表明GmVIT1 在大豆組織中表達量由高到低為花、莢、葉、根、莖、種子?；ㄖ斜磉_量為種子的100 倍。在外源ABA 誘導(dǎo)下，GmVIT1的mRNA豐度隨處理時間延長而逐漸降低，在誘導(dǎo)24 h時，GmVIT1表達量最低，是誘導(dǎo)前的1/2000倍；在NaCl處理下，GmVIT1的mRNA積累在2 h達到峰值，為處理前的57倍，隨后逐漸降低。結(jié)果顯示，GmVIT1 的mRNA 轉(zhuǎn)錄受ABA 負調(diào)控，且受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達，進一步表明該基因參與植物耐鹽脅迫及ABA響應(yīng)途徑。

2.5 轉(zhuǎn)GmVIT1大豆毛狀根耐鹽性分析

為確定GmVIT1 差異表達對大豆耐鹽性影響，利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599 作大豆毛狀根試驗。通過轉(zhuǎn)化獲得表達GmVIT1 基因的毛狀根，將長勢一致毛狀根置于含150 mmol·L-1NaCl的水中處理，以水處理為對照，處理7 d 后（見圖7），轉(zhuǎn)空載體大豆毛狀根地上部分比轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根更萎蔫，長勢矮小，且轉(zhuǎn)GmVIT1 基因大豆毛狀根增長量是對照的2～3 倍，表明在根部過表達GmVIT1 提高大豆耐鹽脅迫的能力。

2.6 轉(zhuǎn)GmVIT1擬南芥耐鹽性分析

利用花絮侵染法轉(zhuǎn)GmVIT1 基因擬南芥，T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定見圖8。選取3 個轉(zhuǎn)基因T3代擬南芥株系，熒光定量PCR（qRT-PCR）分析GmVIT1在3 個轉(zhuǎn)基因株系中表達量（見圖9）。結(jié)果顯示，GmVIT1在轉(zhuǎn)基因株系1中表達量最低，株系3中其次，株系2中最高，且GmVIT1在株系2中表達量是株系1的14倍，株系3的2倍。

利用不同濃度NaCl 處理轉(zhuǎn)基因擬南芥，分析擬南芥在鹽脅迫下的萌發(fā)、子葉綠化及根系表型。萌發(fā)和子葉綠化結(jié)果顯示（見圖10A），正常MS 培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)和綠化與野生型無明顯區(qū)別。隨NaCl 濃度增加，擬南芥生長受抑制，但轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)和綠化均高于野生型。NaCl 濃度為100 mmol·L-1，轉(zhuǎn)基因擬南芥3 個株系萌發(fā)率分別是野生型擬南芥的1.09、16.93 及12.7倍，綠化率分別是野生型擬南芥的1.5、3.62 及1.98倍。鹽脅迫下根長結(jié)果顯示（見圖10B），在正常MS培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥均正常生長。鹽脅迫下擬南芥生長受抑制，但轉(zhuǎn)基因擬南芥根長在不同濃度NaCl 脅迫下均長于野生型擬南芥。

土壤鹽脅迫試驗顯示（見圖11），隨800 mmol·L-1NaCl 處理時間延長，野生型擬南芥逐漸萎蔫，大部分葉片失綠枯死，存活率22%，而轉(zhuǎn)GmVIT1 基因擬南芥少數(shù)葉片葉邊緣逐漸失綠發(fā)白并枯死，3個株系存活率分別為66%、87%及73%。

3 討論與結(jié)論

鹽脅迫對植物產(chǎn)生危害主要為離子脅迫、滲透脅迫和氧化脅迫[12]。在鹽漬化土壤中，植物體內(nèi)離子含量也受鹽脅迫影響[13]。大豆在受到鹽脅迫時，植株地上部分鐵離子含量升高[2]。因此，調(diào)控植物體內(nèi)鐵離子含量可能提高大豆植株耐鹽能力。液泡鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白VITs 可將細胞質(zhì)內(nèi)過量鐵離子轉(zhuǎn)運至液泡中以維持胞內(nèi)離子含量處于最佳生理范圍，保證細胞正常生長[11]。

本試驗在大豆中克隆獲得GmVIT1基因，其蛋白序列含有類CCC1結(jié)構(gòu)域。DNAMAN多重比對結(jié)果顯示，GmVIT1 蛋白序列與不同物種VIT 基因蛋白序列相似度較高，且均含有VIT1 保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化樹分析表明，GmVIT1 屬于VITs 家族成員。TAIR網(wǎng)站顯示，GmVIT1在擬南芥中同源基因為AT3G43660，二者同源率高達77%。研究表明，AT3G43660 蛋白序列與AtVIT1 高度同源，含有類CCC1 結(jié)構(gòu)域，參與植物細胞中鐵離子運輸[14]。VITs 家族的AtVIT1[6]、TgVIT1[15]及OsVIT1[11]均定位在液泡膜上。亞細胞定位結(jié)果表明，GmVIT1定位在液泡膜上，表明GmVIT1為VITs家族成員，參與液泡與細胞質(zhì)間鐵離子轉(zhuǎn)運。

ABA 調(diào)控鹽脅迫分為ABA 依賴和非ABA 依賴兩種途徑[16]。目前，已知參與ABA 依賴途徑調(diào)控植物鹽脅迫的基因有GmMYBs[17]、GmWRKYs[18]及GmbZIPs[19]等。分析GmVIT1 在外源ABA 誘導(dǎo)下的表達模式，GmVIT1 負響應(yīng)ABA 誘導(dǎo)，表明GmVIT1可能通過ABA依賴途徑參與鹽脅迫；在鹽脅迫下發(fā)現(xiàn)GmVIT1 受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達。GmVIT1在大豆各組織表達與Cao等[20]研究結(jié)果，在大豆根、莖、葉及花等組織中均表達，且表達量差異較大，在花中表達量最高。

將GmVIT1在大豆毛狀根中過表達，分析轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根耐鹽性，發(fā)現(xiàn)單獨在根系中過表達GmVIT1 可保障根在鹽脅迫下生長，增加大豆根系耐鹽能力，從而保證地上部分正常生長，因此轉(zhuǎn)GmVIT1 大豆毛狀根地上部分長勢好于轉(zhuǎn)空載體。將GmVIT1在擬南芥中過表達，分析轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中整株表達GmVIT1可提高植株整體耐鹽性。結(jié)果表明大豆GmVIT1在不同組織中均參與植株耐鹽響應(yīng)，在大豆耐鹽方面發(fā)揮重要作用。

周榮芳等通過分析VITs 家族啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)，VIT 基因可能參與植物抗脅迫過程[8]。通過前期分析GmVIT1啟動子發(fā)現(xiàn)，GmVIT1啟動子上含有1 個MYB 結(jié)合位點以及其他與逆境相關(guān)的作用元件。推測GmVIT1可能通過啟動子元件CCAAT-box與MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，參與MYB 調(diào)控鹽脅迫途徑。因此，后續(xù)應(yīng)通過大豆遺傳轉(zhuǎn)化、蛋白互作及其他分子生物學(xué)試驗，驗證GmVIT1參與的調(diào)控途徑及其具體功能。