黃 玲 ，李記明 ，李蘭曉 ，徐 巖 ，唐 柯 *

（1. 江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122；2. 張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰?研發(fā)中心，山東 煙臺(tái)，264000）

冰葡萄酒是利用-8℃的氣溫下，在葡萄架上自然冰凍的葡萄釀造而成的葡萄酒 （Vintners Quality Alliance，VQA），其獨(dú)特的釀造工藝使其與普通葡萄酒在風(fēng)味特征上具有較大差異。 中國(guó)桓仁地區(qū)因其具備釀造冰葡萄酒的典型的氣候特征，現(xiàn)在已經(jīng)成為世界上重要的冰葡萄酒生產(chǎn)地之一。 隨著中國(guó)冰葡萄酒市場(chǎng)的逐漸擴(kuò)大，冰葡萄酒也越來(lái)越受到廣大消費(fèi)者的歡迎[1]。 然而中國(guó)冰葡萄酒尚存在風(fēng)格特點(diǎn)不明確的問題，并且在品質(zhì)上較世界主要冰酒產(chǎn)國(guó)（加拿大、德國(guó)等）生產(chǎn)的冰葡萄酒還有待改善[2]，而解析和確定冰葡萄酒中的香氣成分是實(shí)現(xiàn)冰葡萄酒風(fēng)味調(diào)控、提高冰葡萄酒品質(zhì)的首要問題。

近年來(lái)，葡萄酒中揮發(fā)性成分的檢測(cè)分析主要基于一維氣相色譜[3]。 李艷霞等[4]采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜及質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)威代爾冰葡萄酒中的香氣成分進(jìn)行了分析，分離并定性了其中的59種香氣化合物，主要為酯類、醇類、酸類和呋喃類化合物。 隨后，王玉峰等[5]、秦紹智等[6]、王蓓等[7]分別采用溶劑萃取法結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用、液液萃取結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用以及攪拌棒吸附萃取結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用等方法對(duì)不同葡萄品種冰葡萄酒（包括赤霞珠、威代爾及雷司令冰葡萄酒）中主要香氣成分進(jìn)行了分析。 在氣-質(zhì)聯(lián)用的基礎(chǔ)上，馬玥等[8]進(jìn)一步采用固相萃取結(jié)合嗅聞 （gas chromatography-olfactometry，GC-O）對(duì)威代爾冰葡萄酒中具有重要貢獻(xiàn)的香氣化合物展開了研究，并在威代爾冰酒中檢測(cè)出對(duì)冰酒香氣有重要貢獻(xiàn)的3-甲硫基丙醛及菠蘿酮等之前未報(bào)道過(guò)的冰葡萄酒中重要的香氣活性物質(zhì)[9]。 這些研究豐富了對(duì)冰葡萄酒中香氣化學(xué)成分的認(rèn)識(shí)并對(duì)冰葡萄酒風(fēng)味輪廓的解析奠定了基礎(chǔ)。

然而，常規(guī)的一維氣相色譜經(jīng)常出現(xiàn)樣品中色譜峰重疊的現(xiàn)象并影響定性結(jié)果的準(zhǔn)確性。 相對(duì)于一維氣相色譜，全二維氣相色譜具有更高的分辨率、靈敏度以及峰容量，已廣泛用于復(fù)雜體系樣品的分離分析[10]。 國(guó)外已經(jīng)將全二維氣相色譜大量的用于酒精飲料（如葡萄酒[11]、伏特加[12]、啤酒[13]、利口酒[14]等）、奶制品[15]、茶[26]等的風(fēng)味成分的剖析，而國(guó)內(nèi)也已有應(yīng)用于白酒[17]、露酒[18]、醋[19]、中藥[20]、龍井茶[21]等揮發(fā)性成分分析的報(bào)道。 但目前利用全二維氣相色譜對(duì)冰葡萄酒的研究還鮮有報(bào)道。 因此作者采用全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（comprehensive two dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC × GC-TOFMS）對(duì)冰葡萄酒中揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，這不僅為后續(xù)深入研究冰葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味輪廓的化學(xué)組成及香氣呈香機(jī)理提供了技術(shù)支撐，也為進(jìn)一步改善冰葡萄酒品質(zhì)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

威代爾冰葡萄酒：煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰井a(chǎn)品；C5-C30 正構(gòu)烷烴：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)（Agilent 7890N 氣相色譜）：美國(guó) Agilent 公司產(chǎn)品；KT-2001冷噴調(diào)制器：美國(guó)Zoex 公司產(chǎn)品；Pegasus 4D 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國(guó)Leco 公司產(chǎn)品。

2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 三相萃取頭、固相微萃取裝置：美國(guó)Supelco 公司產(chǎn)品；B11-2 型恒溫磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司產(chǎn)品；B150/7.5 × 15 mm 磁力攪拌子：山東新華公司產(chǎn)品；電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

頂空固相微萃取[9，17]：取 8 mL 冰葡萄酒樣品置于20 mL 頂空樣品瓶中，加入3 g 氯化鈉及攪拌子。萃取溫度50 ℃，樣品平衡5 min，萃取45 min，轉(zhuǎn)速250 r/min。萃取結(jié)束后進(jìn)樣，將萃取頭置于GC 進(jìn)樣口（250 ℃）解析附 5 min。

氣相色譜條件：色譜柱：一維色譜柱DB-FFAP（60 m × 0.25 mm ID，0.25 μm），二維色譜柱 Rxi-17Sil MS（1.1 m × 0.25mm ID，0.25 μm）。 色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，以不分流模式進(jìn)樣。 一維柱溫箱升溫程序：起始溫度 45 ℃保持 2 min，以 4 ℃/min 的速率升溫至230 ℃并保持15 min。 調(diào)制器調(diào)制時(shí)間4 s，熱調(diào)制時(shí)間為 1 s，調(diào)制補(bǔ)償溫度為 20 ℃。 二維柱溫箱升溫程序：起始溫度40 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升溫至250 ℃并保持5 min。以高純氦氣作為載氣，恒流模式，流量：1 mL/min。

飛行時(shí)間質(zhì)譜條件：采用EI 離子源，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，電壓控制70 eV。檢測(cè)器采集質(zhì)量數(shù)范圍35～400，采集頻率100 spectrum/s，電壓控制1 430 V。 數(shù)據(jù)由LECO 公司Pegasus 4D工作站采集。

數(shù)據(jù)處理：利用儀器自帶ChormaTOF 軟件對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，色譜峰的峰寬分別設(shè)為24 s 和0.2 s，自動(dòng)識(shí)別信噪比大于200 的色譜峰后進(jìn)行自動(dòng)積分解卷積和質(zhì)譜庫(kù)（mainlib，Wiley 9 和replib）比對(duì)，進(jìn)一步通過(guò)保留指數(shù)（保留指數(shù)根據(jù)C5-C30計(jì)算得出）定性并剔除烷烴類等無(wú)明顯風(fēng)味貢獻(xiàn)及胺類等主要呈味的化合物，選擇相似度及反相似度不小于800 的化合物作為最終鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 威代爾冰葡萄酒揮發(fā)性成分定性分析

基于全二維氣相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用的方法，共在威代爾冰葡萄酒中檢測(cè)到953 個(gè)色譜峰，如圖1 所示。

圖1 威代爾冰葡萄酒GC × GC-TOFMS 分析一維及二維總離子流圖Fig. 1 GC × GC -TOFMS total 1D and 2D ion chromatogram of volatile compounds of Vidal icewine

通過(guò)Pegasus 4D 工作站對(duì)質(zhì)譜庫(kù)的檢索結(jié)合保留指數(shù)比對(duì)，共定性了其中的253 種香氣化合物，其中包括酯類53 種，醇類40 種，芳香族化合物39 種，萜烯類 35 種，醛酮類 25 種，呋喃類 21 種，酸類12 種，硫化物9 種，內(nèi)酯類9 種，其他雜環(huán)化合物 10 種（圖 2）。 相較于一維 GC-MS 對(duì)冰葡萄酒香氣的分析[4-9，22]，GC × GC-TOFMS 表現(xiàn)出更好的分離效果。 例如，在威代爾冰葡萄酒中檢測(cè)到的2-糠酸乙酯、β-環(huán)檸檬醛和γ-戊內(nèi)酯一維出峰時(shí)間均為1696 s，但在二維上（出峰時(shí)間分別為 8.4、15.1 s 和17.9 s）能夠很好的分離得到3 個(gè)單獨(dú)的色譜峰。

圖2 威代爾冰葡萄酒鑒定出化合物種類及數(shù)目Fig. 2 Classification of volatile compounds qualified in Vidal icewine

在鑒定出的揮發(fā)性成分中，酯類、醇類及芳香族化合物占所有化合物的52%。 酯類在葡萄酒中主要呈果香，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯等呈香蕉菠蘿等熱帶水果的香氣。 除飽和脂肪鏈酯類外，還檢測(cè)到丙烯酸丁酯、2-己烯酸乙酯、9-癸稀酸乙酯等不飽和脂肪酸酯。 醇類也是葡萄酒中重要的風(fēng)味化合物，如順-3-己烯醇通常表現(xiàn)出青草的清香。 芳香族中苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇等均在葡萄酒中表現(xiàn)出花香，同時(shí)檢出的百里香酚、愈瘡木酚、4-乙基愈瘡木酚、 丁香酚等可提供煙熏煙草的香氣。

萜烯類化合物主要來(lái)源于用于釀酒的葡萄中，是葡萄酒一類香氣品種香的重要組成[23]。 作者共檢測(cè)到35 中萜烯類化合物（表1）。 王蓓等[7]利用攪拌棒吸附萃取結(jié)合一維氣-質(zhì)聯(lián)用在威代爾冰葡萄酒中檢測(cè)到24 種萜烯類化合物Ma 等[9]通過(guò)GC-OMS 在威代爾冰葡萄酒中共檢測(cè)到11 種萜烯。 作者鑒定出的 3-p-薄荷烯、 月桂烯、α-水芹烯、β-水芹烯、（E）-羅勒烯、 胡椒酮、cis-冬青油醇等化合物均未在基于一維氣-質(zhì)威代爾冰葡萄酒揮發(fā)性成分檢測(cè)中有過(guò)相關(guān)報(bào)道。 3-p-薄荷烯、胡椒酮在葡萄酒中主要呈現(xiàn)薄荷的清香，月桂烯呈天竺葵和藥香，水芹烯呈水果和薄荷的香氣[24]，但這些香氣化合物在冰葡萄酒中的風(fēng)味貢獻(xiàn)有待進(jìn)一步研究。 β-大馬酮、玫瑰醚分別呈蜂蜜和花香，在冰葡萄酒模擬液中閾值分別為 1.05 μg/L、0.09 μg/L[25]，這兩種化合物被報(bào)道對(duì)冰葡萄酒香氣具有重要貢獻(xiàn)[8-9]。 TDN（1，1，6-三甲基-1，2-二氫萘）在葡萄酒中呈現(xiàn)汽油味，是雷司令葡萄酒中的典型香氣特征，王蓓等[7]關(guān)于威代爾冰葡萄酒香氣成分的分析中也曾檢測(cè)到該化合物。

含硫化合物其低閾值及獨(dú)特的香氣特征使其成為現(xiàn)今食品風(fēng)味研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 大多數(shù)的揮發(fā)性硫化物被認(rèn)為是異嗅化合物，但也有部分硫化物對(duì)食品的風(fēng)味特征具有重要作用。 據(jù)報(bào)道，糠硫醇是芝麻香型白酒中呈現(xiàn)其獨(dú)特芝麻香氣的關(guān)鍵化合物[17]。目前冰葡萄酒中關(guān)于硫化物的報(bào)道還較少，本研究在威代爾冰葡萄酒中檢測(cè)到了9 種硫化物，分別是二甲基硫、甲硫醇、3-甲硫基丙酸乙酯、3-甲硫基丙醛、2-噻吩甲醛、4-甲基-5-乙烯基噻唑、2-甲硫基乙酸乙酯、 順-2-甲基-4-丙基-1，3-氧硫雜環(huán)己烷、3-乙硫基丙醇。 其中3-甲硫基丙醛在冰葡萄酒中主要表現(xiàn)為煮土豆的香氣特征，并且對(duì)冰葡萄酒整體香氣感知具有顯著影響[9]。 二甲基硫表現(xiàn)為白菜、蘆筍、玉米和糖漿的香氣。 這些硫化物在冰葡萄酒中的具體貢獻(xiàn)和作用目前還并不明晰，是否對(duì)冰葡萄酒的香氣起修飾作用或是增加冰葡萄酒的復(fù)雜性，這些問題均有待進(jìn)一步研究。

表1 威代爾冰葡萄酒中的萜烯類化合物Table 1 Terpenes in Vidal icewine

續(xù)表1

2.2 威代爾冰葡萄酒揮發(fā)性成分相對(duì)含量

根據(jù)定性出的化合物的出峰時(shí)間及峰面積繪制氣泡圖（圖3），氣泡的大小表示峰面積的大小，由圖可知，酯、醇、酸、芳香族化合物峰面積較高，而大多數(shù)呋喃、醛酮、內(nèi)酯、硫化物、萜烯等峰面積均較低。 其中相對(duì)含量（峰面積占總化合物峰面積比例）高于 0.5%的化合物有 31 種 （表 2），包括乙酸、己酸、異丁醇、正己醇、1-丁醇、1-丙醇、1-辛烯-3-醇、1-戊醇、3-辛醇、1，2-丙二醇、順-3-己烯醇、2，3-丁二醇、1-庚醇、乙酸乙酯、琥珀酸二乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、糠醛、乙醛、3-羥基-2-丁酮、苯甲醛、2，4-二叔丁基苯酚、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、2-甲氧基-3-甲基吡嗪、4-萜品醇、脫氫芳樟醇、橙花醇氧化物。 其大部分為酯類和醇類，還包括3 種萜烯化合物，這些化合物構(gòu)成了冰葡萄酒揮發(fā)性組分的主體，可能為冰葡萄酒提供馥郁的果香、花香。 Ma 等[9]通過(guò)重組缺失實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菠蘿酮和3-甲硫基丙醛對(duì)威代爾冰葡萄酒焦糖的香氣具有重要影響，說(shuō)明香氣化合物對(duì)葡萄酒整體香氣的貢獻(xiàn)并不完全取決于其含量。 同時(shí)，萜烯、硫化物等痕量化合物具有較低的閾值，因此，進(jìn)一步通過(guò)確定痕量化合物的含量并結(jié)合閾值等探究其對(duì)冰葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)及價(jià)值，能夠更全面深入的了解冰葡萄酒的風(fēng)味輪廓。

圖3 威代爾冰葡萄酒中揮發(fā)性化合物分布Fig. 3 Scatter plot of volitale compounds in Vidal icewine

表2 相對(duì)面積分?jǐn)?shù) （峰面積占化合物總峰面積比例） 高于0.5%的香氣化合物Table 2 Aroma compounds in Vidal icewine with relative peak area over 0.5%

續(xù)表2

3 結(jié) 語(yǔ)

采用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析了威代爾冰葡萄酒揮發(fā)性成分，共定性了其中的253 種香氣化合物，其中，共檢測(cè)到35 種萜烯和9 種含硫化合物。 3-p-薄荷烯、月桂烯、α-水芹烯、β-水芹烯、（E）-羅勒烯、胡椒酮、cis-冬青油醇等萜烯化合物均未在一維氣-質(zhì)威代爾冰葡萄酒揮發(fā)性成分檢測(cè)中有過(guò)相關(guān)報(bào)道。 同時(shí)，對(duì)香氣化合物相對(duì)含量進(jìn)行了分析，其中相對(duì)面積分?jǐn)?shù)（峰面積占總化合物峰面積比例）高于0.5%的香氣化合物有31 種，這些化合物可能是形成冰葡萄酒香氣的重要組成部分。 但由于香氣化合物對(duì)葡萄酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)不僅取決于化合物的含量，也受其閾值的影響。 一些低閾值的痕量化合物如萜烯、硫化物等也可能會(huì)對(duì)冰葡萄酒香氣具有重要影響，因此這些化合物對(duì)冰葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)有待結(jié)合精確的定量分析進(jìn)行進(jìn)一步的研究。