杜朝東 ，于 添 ，叢 欣 ，陳尚衛(wèi) ，朱 松 *

（1. 食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇無錫 214122；2. 恩施德源健康科技發(fā)展有限公司，湖北 恩施445000）

硒是一種人類必須的微量元素，具有抗氧化［1～2］、抗腫瘤［3］、抗疲勞［4～5］和拮抗有害金屬［6］等生物活性。中國營養(yǎng)學會將硒列為每日膳食營養(yǎng)素，建議成人每日適宜攝入量應在 50～250 μg，2014 年將最低攝入量提升至60 μg。 我國約有70%的區(qū)域處于低硒地帶，所以適當補充硒是必要的。 硒分為有機硒和無機硒。由于吸收方式不同，有機硒的生物利用度遠遠高于無機硒，其中硒代蛋氨酸（Se-Met）的生物利用度更是在90%以上，因此正確的補硒方式為適當補充富含有機硒的食物，有機硒主要以硒蛋白和硒多糖的形式存在，其中以硒蛋白為主［7］。硒蛋白的提取是研究硒蛋白性質的前提，常用的提取方法為溶劑提取法，同時輔以攪拌、超聲或凍融等，但超聲或凍融處理會破壞硒蛋白結構，甚至降低硒代氨基酸含量，使有機硒含量降低，不利于硒蛋白的提取。 提取溶劑通常選用水、堿、醇、鹽等，根據根據蛋白種類選用適宜的溶劑，或采用不同溶劑多次提取以提高硒蛋白提取率，高林［8］對采用堿提法提取富硒花生中的硒蛋白，蛋白得率高達87%。

恩施碎米薺是一種超富硒植物，硒質量分數高達 1 400 mg/kg［9-10］，劉坤媛等［11］研究發(fā)現碎米薺蛋白中有機硒的含量遠遠高于富硒酵母、 富硒花生等，其中有機硒以硒蛋白為主［12］。 硒蛋白中硒的形態(tài)主要以硒代半胱氨酸（Se-Cys）和Se-Met 為主，這使得碎米薺硒蛋白中硒更易于被人體吸收利用。 當前人們對碎米薺硒蛋白有一定研究，國外對碎米薺硒蛋白的研究主要集中在碎米薺硒蛋白的生物利用度、結構與功能上［13］，而國內主要集中在碎米薺硒蛋白的結構特性、抗疲勞［11］和體內抗氧化上［14］，但對碎米薺堿提蛋白的研究較少。

作者以恩施碎米薺為原料，首先優(yōu)化碎米薺硒蛋白提取工藝，初步探討碎米薺蛋白抗氧化活性，為開發(fā)高附加值的碎米薺硒蛋白提供數據支持，拓展其在功能性食品方面的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓳葉碎米薺：由恩施德源健康科技發(fā)展有限公司提供。

牛血清蛋白 BR，國藥集團化學試劑限公司；福林酚、碳酸鈉、硼氫化鉀、鐵氰化鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、福林酚試劑、五水合硫酸銅、四水合酒石酸鈉 AR，國藥集團化學試劑有限公司；硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸 北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-10N 冷凍干燥機：寧波生物科技有限公司產品；SHA-B 雙功能水浴振蕩器：天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠產品；721N 型可見光分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司產品；TD6 臺式低速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司產品；AF-600 原子熒光光譜儀：北京瑞利分析儀器有限公司產品；Waters1525 高效液相色譜儀（配2487 紫外檢測器和Empower 工作站GPC 軟件）：美國沃特世公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 總蛋白質含量測定 凱氏定氮法，參考國標GB/T 5009.5-2016 進行。

1.3.2 提取溶劑的選擇 參考陳雪青［15］的方法確定碎米薺蛋白種類：將干燥好的碎米薺打粉，過80目篩，稱取4 份碎米薺粉末各20 g，按1 g:40 mL，分別加入去離子水、NaCl 溶液（1 mol/L）、乙醇溶液（體積分數 80%）、堿液（0.1 mol/L 的 NaOH 溶液），在 50 ℃下攪拌 8 h，2 810 g 離心 15 min，收集上清液，測定蛋白含量，比較各溶劑的得率，從而確定提取溶劑。

1.3.3 蛋白質得率的計算 溶液中蛋白質的測定參考胡宇航等［16］的方法（Folin-酚法）。 繪制牛血清蛋白標準曲線為Y=0.002 3X+0.0262，Y 為反應液的吸光度；X 為溶液中蛋白質的濃度，μg/mL； 相關系數為 R2=0.999 3，線性范圍為 0～340 μg/mL。

蛋白質得率計算公式為：

蛋白質得率 （%）=提取液中蛋白質的質量（g）/恩施碎米薺質量（g）×100

1.3.4 蛋白提取工藝研究

1） 碎米薺蛋白提取工藝單因素實驗 參考李寶瑞等［17］的方法，考察提取溫度、提取時間、料液質量體積比和堿液濃度對蛋白質得率的影響，研究碎米薺硒蛋白提取工藝。

2）兩次提取對提取率的影響 稱取4 g 碎米薺粉末按料液質量體積比1 g:40 mL，加入去離子水，在50 ℃下攪拌 8 h，2 810 g 離心 15 min，收集上清液，測定蛋白含量，再次向殘渣中按1 g:40 mL 加入去離子水，在 50 ℃下攪拌 8 h，2 810 g 離心 15 min，收集上清液，測定蛋白含量，得出兩次水提?。ㄋ┑牡鞍踪|得率。 參考上述方法測定現水提后堿提（水—NaOH 溶液）和兩次堿提（NaOH 溶液—NaOH溶液）的蛋白得率。

1.3.5 碎米薺蛋白相對分子質量分布 稱取0.5 g蛋白樣品溶于2 mL 流動相，2 810 g 離心15 min，上清液經0.22 μm 水相過濾膜過濾，裝入液相小瓶中，樣品制備完成后在以下色譜條件下進樣：色譜柱為 TSKgel 4000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流動相為水，流量為0.5 mL/min，檢測波長為220 nm，柱溫為 30 ℃。

1.3.6 碎米薺蛋白純化 將水提蛋白經超濾膜超濾濃縮，收集截留液，凍干；將堿提蛋白旋轉蒸發(fā)濃縮 4 倍，調節(jié) pH 至等電點（pH=2.9），4℃靜置過液，離心15 min，收集沉淀，凍干，測定兩種產物中的蛋白和硒含量。

1.3.7 硒含量的測定 總硒含量的測定參考GB 5009.93-2010。硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的測定采用HPLC-AFS 法［18、19］，檢測條件為：載 氣 流 量為 800 mL/min，燈電流為90/0 mA，負高壓為320 V。 流動相為0.015 mol/L 的 KH2PO4和 0.01 mol/L 的 KCl 溶液。色譜柱PRP-X100 液相色譜柱。

1.3.8 碎米薺堿提蛋白和水提蛋白自由基清除性能檢測 碎米薺硒蛋白對·OH 清除率的測定參考任堯［20］的方法；碎米薺硒蛋白對DPPH·清除率的測定參考 Zhao 等［21］的方法。

1.3.9 堿提蛋白的純化及其自由基清除活性 將適量的Sephadex G-100 凝膠用超純水浸泡24 h，用1 mol/L NaOH 溶液浸泡1 h，然后用純水洗滌凝膠至中性，減壓抽濾1 h，立即裝入玻璃層析柱（規(guī)格），用 0.5 mol/L pH8.0 Tris-HCl 洗脫液平衡 2 h，保持流速為0.5 mL/min，上樣3 mL（1.2.7 中最優(yōu)提取條件下得到的堿提蛋白溶液），每10 min 接收1管，在波長220 nm 處檢測，將各組份收集，凍干，測定各組份的自由基清除率及硒含量。

1.4 數據處理

實驗數據采用SPSS 23 處理，采用Excel 2013、Origin 9.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 碎米薺蛋白提取溶劑的選擇

碎米薺原料蛋白質質量分數為14.4%。 由圖1所示，樣品經去離子水，1 mol/L NaCl 溶液，0.1 mol/L NaOH 溶液和體積分數80%乙醇溶液提取，得率分別為39.0%、32.7%、53.4%和5.2%。由上述可知碎米薺中堿提蛋白含量最高，其次為水提蛋白，然后依次為鹽提蛋白和醇提蛋白，各種蛋白質質量分數之間存在著顯著性差異（P＜0.05）。 為了獲得較高的蛋白質質量分數，所以首先研究以堿液為提取劑時不同提取條件對碎米薺蛋白質得率的影響。

圖1 提取溶劑對蛋白質得率的影響Fig. 1 Effect of extraction solvent on extraction yield of cardamine protein

2.2 碎米薺蛋白提取單因素實驗

2.2.1 堿液濃度對碎米薺蛋白得率的影響 堿液濃度是影響碎米薺蛋白提取的主要因素。 由圖2 可知，隨著堿液濃度的增加得率逐漸增加，在P＜0.05時，具有顯著性差異。 可能是由于蛋白被水解末端羧基與末端氨基增多，增加蛋白的親水性，當堿液濃度達到0.1 mol/L 后，得率增加相對變緩，當堿液濃度在0.15 mol/L 后，得率增加緩慢，有研究表明堿性太強會造成 Lys、Cys、Ser、Thr 降解，甚至會產生賴氨酰丙氨酸［22］。而且由于Cys 被破壞，導致有機硒含量降低。 綜合上述因素與經濟因素選用0.1 mol/L為提取最佳堿液濃度。

圖2 堿液濃度對蛋白得率的影響Fig. 2 Effect of alkali concentration on extraction yield of protein

2.2.2 提取溫度對碎米薺蛋白質得率的影響 由圖3 可看出，得率隨溫度的增加而增加。 當溫度達到50 ℃后，得率不再增加，甚至有所降低，這與李大鵬等［23］提取豆粕中大豆分離蛋白現象一致。 可能是由于隨著溫度的升高，分子的熱運動增強，蛋白質的構象發(fā)生改變，有利于蛋白質的溶解；但是溫度過高可能使蛋白質變性而沉淀，而且隨著溫度的升高，提取物中多酚、色素的含量也會隨之升高，降低蛋白樣品中蛋白含量和品質。 所以綜合考慮選取50℃為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對蛋白質得率的影響Fig. 3 Effect of temperature on extraction yield of protein

2.2.3 提取時間對碎米薺蛋白得率的影響 由圖4看出隨著時間的延長，得率逐漸增加，當達到8 h 時，得率達到最高，后逐漸下降，可能是由于提取時間過長蛋白變性而沉淀，且隨著時間的延長，原料中的多酚及色素等物質也會被大量提取進溶劑中，降低蛋白品質，甚至部分多酚與蛋白結合使蛋白沉淀，造成蛋白損失，且對不利于后續(xù)純化過程。 所以從得率、經濟和蛋白保存方面來看，8 h 為最佳提取時間。

圖4 提取時間對蛋白得率的影響Fig. 4 Effect of time on extraction yield of protein

2.2.4 料液質量體積比對碎米薺蛋白質得率的影響 由圖5 得出得率隨料液質量體積比的增大而增大，且存在顯著性差異（P＜0.05）。當料液質量體積比為1 g:40 mL 以后，得率增加速率降低，可能是由于當料液質量體積比較低時如1 g:20 mL，溶液的粘度大，蛋白濃度大，固相和液相濃度差較小，推動力小，得率小，同時由于固相中吸附較多的提取液，導致蛋白得率較低；當料液比大于1 g:40 mL 后得率增速變緩，但料液體積增大，旋蒸濃縮所需時間過長，且蛋白顏色過深，由棕色變?yōu)楹谏赃x擇1 g:40 mL為最佳提取料液質量體積比。

圖5 料液質量體積比對蛋白質得率的影響Fig. 5 Effect of ratios of water to material on extraction yield of protein

圖6 兩次提取時提取溶劑的選擇Fig. 6 Selection of extraction solvents for two extractions

2.2.5 兩次提取對碎米薺蛋白得率的影響 為了提高碎米薺蛋白得率，采用兩步提取法提取蛋白。由圖 6 可知，水—水、水—NaOH 溶液（0.1 mol/L）和NaOH 溶液—NaOH 溶液提取的得率分別為36.5%，75.4%和67.8%。 其中采取水—NaOH 溶液 組合時得率最高，可能是由于水溶蛋白和堿溶蛋白分別占碎米薺總蛋白的30.0%和53.4%，若只采用一種提取劑僅能將對應的蛋白提取出來而其他種類的蛋白則溶出較少。 且因為醇溶蛋白和鹽溶蛋白含量較低，提取價值不大，所以提取蛋白時采用水—NaOH溶液組合。

綜上所述提取溫度50 ℃，料液質量體積比為1 g:40 mL，先水提8 h 后堿提8 h 為最佳提取工藝。得到的水提蛋白經超濾凍干后得到的樣品蛋白質質量分數為26.5%，硒質量分數為1 748 μg/g，堿提蛋白經酸沉后蛋白質質量分數為52.3%，硒質量分數為 1 513 μg/g。

2.2.6 碎米薺蛋白相對分子質量分布 分別測定2.2.5 中提取得到的蛋白質相對分子質量分布，得圖7 和圖8。 水提蛋白的相對分子質量主要為87 694、9 928、5 997，堿提蛋白相對分子質量主要為84 992和5 800，二者蛋白相對分子質量均小于100 000，證明碎米薺蛋白相對分子質量小于100 000。

圖7 水提蛋白相對分子質量分布Fig. 7 Water extract protein molecular weight distribution

圖8 堿提蛋白相對分子質量分布Fig. 8 Alkaline extraction protein molecular weight distribution

2.3 碎米薺蛋白對·OH 和DPPH 自由基清除能力的測定

由圖 9 可知，維生素 C 清除·OH 能力最強。 碎米薺水提蛋白對·OH 的清除能力大于堿提蛋白，且二者的·OH 的清除能力均比大豆蛋白強（P＜0.05）。同時三者的硒含量也是碎米薺水提蛋白最高，碎米薺堿提蛋白次之，大豆蛋白最低（P＜0.05），說明蛋白硒含量越高，其.OH 的清除能力越大，這與 Zhao 等［21］的結論相同。

圖9 碎米薺蛋白對·OH 的清除率Fig. 9 Clearance rate of·OH in cardamine protein

由圖10 可知維生素C 清除DPPH 自由基能力最強，其次為碎米薺水提蛋白，其在1 mg/mL 時清除率為82.5%，碎米薺堿提蛋白為64.4%，大豆蛋白對DPPH 自由基清除率最低，為 56.8%，其中 IC50大豆蛋白（1.542 mg/mL）＞ IC50堿提蛋白（1.345 mg/mL）＞ IC50水提蛋白（0.4490 mg/mL）三者的硒含量從高至低為碎米薺水提蛋白、碎米薺堿提蛋白和大豆蛋白。 說明蛋白對DPPH 自由基的清除能力與硒的含量有關，硒含量越高，清除DPPH 自由基的能力越強。 綜上所述，水提蛋白抗氧化能力最強其次為堿提蛋白，Du等［24］和岳念晶等［25］分別對富硒靈芝和富硒大蒜研究發(fā)現相似結果。

圖10 碎米薺蛋白對DPPH·的清除率Fig. 10 DPPH·clearance rate of cardamine protein

2.4 堿提蛋白的純化及其自由基清除能力

由于碎米薺蛋白中堿提蛋白含量最高，且對其研究較少，所以對水—NaOH 溶液提取得到的堿提蛋白進行分離純化，將1.2.5 中水—NaOH 溶液提取得到的碎米薺堿提蛋白經Sephadex G-100 凝膠分離，在紫外280 nm 下測得兩個峰，分別為80～160 min（峰 1），160～310 min（峰 2）結果見圖 11。 參考2.2.6 中堿提蛋白相對分子質量分布可知，峰1 的蛋白相對分子質量為8.5×104，峰2 的蛋白相對分子質量為 5.8×104，上述峰1、峰2 兩組分的硒質量分數分別為 668、650 mg/kg。

圖11 碎米薺堿提蛋白Sephadex G-100 分離圖譜Fig. 11 Elution profile of cardamine alkali extract protein separated in Sephadex G-100 column

碎米薺堿提硒蛋白兩組分氨基酸組成分析結果如表 1 所示。 峰1 蛋白中氨基酸質量分數為38.8%。 峰2 的氨基酸質量分數為32.4%。 2 種蛋白中各氨基酸占各自總氨基酸的比例相差不大，其中峰1 和峰2 中7 種必需氨基酸占總氨基酸的41.0%、38.1%，主要區(qū)別在于 Tyr（峰 1：4.36%、峰 2：2.63%）Met （2.06% 、1.54% ）、Lys （6.88% 、5.49% ）、Pro（4.15%、5.81%）和 Cys（0.01%、0.07%），且峰 1 中硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸含量皆高于峰2。

表1 碎米薺堿提蛋白兩組分氨基酸組成Table 1 Composition of amino acid from two components of cardamine alkali

分別對2 個峰進行·OH 和DPPH 自由基清除能力檢測得到圖12～13。 由圖12 可知峰1 與峰2的·OH 清除能力相同，且都大于大豆蛋白對·OH 的清除能力，與堿提蛋白相近且弱于水提蛋白。 由層析圖（圖11）可知，峰1 的含量遠遠大于峰2 的含量，所以從得率的角度來說峰1 優(yōu)于峰2。 由圖13可知維生素C 對DPPH 自由基清除率最大，其次為峰1，清除率為65.7%，峰2 與大豆蛋白對DPPH 自由基的清除能力相差不大，分別為36.3%和39.6%，峰1 清除DPPH 自由基能力強于峰2，可能是由于峰1 的總硒和硒代氨基酸含量比峰2 高，而硒含量的增加有助于蛋白對自由基的清除［26］，由圖14 可知峰1 蛋白相對分子質量為88 257。

圖12 碎米薺純化蛋白對·OH 的清除率Fig.12 Clearanceof·OHbypurifiedproteinfromcardamine

圖13 碎米薺純化蛋白對DPPH·的清除率Fig. 13 DPPH·clearance rate of purified protein from cardamine

圖14 堿提蛋白相對分子質量分布Fig. 14 Alkaline extraction protein molecular weight distribution

3 結 語

以恩施碎米薺為原料，比較不同提取方法對碎米薺蛋白得率的影響，采用單因素法得到最佳工藝為：提取溫度50 ℃，料液質量體積比為1 g:40 mL，先后用水和0.1 mol/L NaOH 溶液分別提取4 h。 在此工藝條件下蛋白得率最高，為75.4%，其中水提蛋白的蛋白質質量分數為26.5%，硒質量分數為1 748 μg/g，堿提蛋白的蛋白質質量分數為52.3%，硒質量分數為 1 513 μg/g。 采用 Sephadex G-100 凝膠層析對碎米薺堿提蛋白進行純化得到兩個組分。 通過研究4 種恩施碎米薺蛋白對DPPH 自由基和羥自由基的清除能力，發(fā)現碎米薺蛋白均具有一定的抗氧化活性。