劉琴 彭珊珊

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的疾病，是妊娠與血壓升高并存的一組疾病，常對(duì)腎臟、心臟、肝臟和腦造成損害，其中首先受到損傷的臟器為腎臟，往往導(dǎo)致母嬰的嚴(yán)重后果[1]。早期評(píng)價(jià)妊娠期高血壓疾病合并腎功能損害，早期采取治療措施，是降低母嬰風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵[2]。有研究證實(shí)妊娠期高血壓疾病發(fā)生與多種基因存在密切聯(lián)系，并且有遺傳背景的孕婦發(fā)生率更高[3]。有研究認(rèn)為微小RNA(miRNA)是參與了高血壓腎病的發(fā)生發(fā)展過程[4，5]，miR-146a和miR-25研究組證實(shí)參與了動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓腎病的病理生理過程[6，7]，而是否參與了妊娠高血壓疾病患者的腎臟損害筆者尚未見報(bào)道。血清胱抑素(CysC)已經(jīng)被證實(shí)較為準(zhǔn)確評(píng)估腎小球?yàn)V過率，是評(píng)價(jià)腎臟功能損害的傳統(tǒng)指標(biāo)[8]。本研究通過聯(lián)合檢測血清miR-146a、miR-25和CysC觀察在檢測妊娠高血壓疾病患者診斷腎功能損害中的臨床意義，結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2018年12月在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院就診的妊娠高血壓疾病患者76例，為妊娠期高血壓疾病組，均符合妊娠期高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)。年齡20～39歲，平均年齡(25.38±2.86)歲；孕周22～37歲，平均孕周(35.68±2.31)周；孕次0～3次，平均孕次(2.35±0.65)次；體重50～73 kg,平均(56.68±3.46)kg；其中經(jīng)產(chǎn)婦16例，初產(chǎn)婦60例，根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度分為：輕度41例，中度22例，重度13例。選擇同期行健康體檢者孕婦45例，為正常妊娠組，年齡20～39歲，平均年齡(26.14±1.68)歲；孕周22～37周，平均(35.09±1.68)周，孕次0～3次，平均孕次(2.19±0.62)次；體重51～75 kg,平均(56.97±2.37)kg；其中經(jīng)產(chǎn)婦10例，初產(chǎn)婦35例。選擇同期在體檢中心健康體檢者30例，為健康對(duì)照組，年齡24～42歲，平均年齡(26.38±2.18)歲；體重54～73 kg，平均(56.86±3.76)kg。3組年齡和體重等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者知情同意，均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性高血壓；妊娠合并感染性疾?。惶寒惓?；合并心、肝、腎和肺等重要障礙功能不全；代謝性，免疫性和腫瘤性疾??；有出血和血栓性疾病。

1.3 方法

1.3.1 血液標(biāo)本采集：患者入院后清晨空腹肘靜脈血約10 ml，4℃的條件下放置30 min，低速離心20 min，離心速度1 800 r/min，離心半徑15 cm，離心后去上清液，將其保存在-70℃冰箱中保存。

1.3.2 miRNA提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：根據(jù)miRNeasy提取試劑盒的說明書提取miRNA，并通過紫外分光度將吸光度的比值在1.8～2.0的標(biāo)本保存用于后續(xù)檢測，保存在-70℃的冰箱中。按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，標(biāo)本保存在-70℃的冰箱中。

1.3.3 qRT-PCR檢測：根據(jù)GenBank中的miR-146a、miR-25和U6的序列號(hào)，并用Premier Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成引物。miR-146a引物序列，上游：CACGGACCTGAAGAACACTGG，下游：AGAAATGAAATTAGAACACACATCAATTCC，miR-25的引物序列，上游：CGGCGGCATTGCACTTGGTCTC和U6引物序列，上游：ATCCGCAAAGACCTGT，下游：GGGTGTAACACTXAAG。qRT-PCR的總反應(yīng)體系為25 L，包括上下游引物各1.0 L(其濃度為10 mmol/L)，cDNA為0.8 L，RNaseH2O為12.2 L和SYBRPPrimix Ex TaqTM 10 ml。反應(yīng)條件為：預(yù)變性溫度95℃10 min，95℃和60℃分別為5 s和60 s，總共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在60℃下用ABI7700軟件收集熒光信號(hào)進(jìn)行溶解曲線分析，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)平行復(fù)孔，相對(duì)表達(dá)量采用表示2-ΔΔCt，公式表達(dá)為ΔΔCt=試驗(yàn)組(Ct目標(biāo)基因-CtU6)-對(duì)照組(Ct目標(biāo)基因-CtU6)。

1.3.4 血清CysC水平檢測：采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)方法對(duì)血清CysC水平進(jìn)行檢測，采用武漢明德生物科技股份有限公司生產(chǎn)的試劑盒，按照使用說明書進(jìn)行檢測，具體步驟：取血清100 μl加入到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別放入反應(yīng)孔中，用膠紙密封后，在37℃的條件下進(jìn)行溫浴，90 min后，用洗滌液洗滌3次，每次5 min。用濾紙干燥反應(yīng)板。除空白對(duì)照組外，其他均加入生物素抗體混合，溫度37℃，反應(yīng)30 min。然后用洗滌液清洗反應(yīng)板3次，每次5 min，避光孵育20 min，每孔加入終止液100 μl終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定，根據(jù)測定值計(jì)算出血清樣本的實(shí)際含量，每個(gè)樣本測定3次，平均量為相對(duì)含量。

1.4 觀察指標(biāo) 比較3組血清miR-146a、miR-25表達(dá)和CysC水平，觀察妊娠高血壓疾病患者血清miR-146a、miR-25表達(dá)和CysC水平與疾病嚴(yán)重程度和腎功能損害的關(guān)系及聯(lián)合檢測在腎功能損害方面的效能。

2 結(jié)果

2.1 3組血清miR-146a、miR-25表達(dá)和CysC水平變化 妊娠期高血壓疾病組患者血清miR-146a和CysC水平明顯高于正常妊娠組和健康對(duì)照組(P<0.01)，正常妊娠組又高于健康對(duì)照組(P<0.01)；而妊娠期高血壓疾病患者血清miR-25表達(dá)水平明顯低于正常妊娠組和健康對(duì)照組(P<0.01)，而正常妊娠組明顯低于健康對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

組別miR-146a(2-ΔΔCt)miR-25(2-ΔΔCt)CysC(mg/L)健康對(duì)照組(n=30)1.20±0.081.97±0.680.68±0.13正常妊娠組(n=45)1.47±0.12*1.49±0.43*0.87±0.18*妊娠期高血壓疾病組(n=76)2.38±0.28*#1.06±0.24*#1.38±0.39*# F值496.94661.28084.451 P值0.0000.0000.000

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.01；與正常妊娠組比較，#P<0.01

2.2 血清miR-146a、miR-25表達(dá)和CysC水平與妊娠期高血壓疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系 隨著妊娠期高血壓疾病嚴(yán)重程度的增加血清miR-146a表達(dá)和CysC水平而出現(xiàn)明顯升高(P<0.01)，而miR-25表達(dá)出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

類別miR-146a(2-ΔΔCt)miR-25(2-ΔΔCt)CysC(mg/L)輕度(n=41)1.86±0.241.26±0.18 0.92±0.21 中度(n=22)2.41±0.22* 0.95±0.21* 1.46±0.28*重度(n=13)3.97±0.27*#0.62±0.12 *#2.70±0.35*#F值471.35383.379284.769P值0.0000.0000.000

注：與輕度比較，*P<0.01；與中度比較，#P<0.01

2.3 血清miR-146a、miR-25表達(dá)和CysC水平與妊娠高血壓疾病出現(xiàn)腎損傷的關(guān)系 妊娠期高血壓疾病患者腎功能異常組的血清miR-146a表達(dá)和CysC水平明顯高于腎功能正常組(P<0.01)，而血清miR-25表達(dá)腎功能異常組明顯低于腎功能正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

組別miR-146a(2-ΔΔCt)miR-25(2-ΔΔCt)CysC(mg/L)腎功能正常組(n=37)2.20±0.201.22±0.201.13±0.25腎功能異常組(n=39)2.55±0.260.90±0.151.62±0.34t值6.5527.9187.126P值0.0000.0000.000

2.4 妊娠期高血壓基本患者血清miR-146a、miR-25表達(dá)和CysC水平相關(guān)性 妊娠高血壓患者血清miR-25表達(dá)與miR-146a表達(dá)(r=-0.768，P<0.01)和CysC水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.812，P<0.01)，而miR-146a表達(dá)與CysC水平呈正相關(guān)(r=0.843，P<0.01)。

2.5 聯(lián)合血清miR-146a，miR-25和CysC水平妊娠期高血壓疾病腎功能損害的診斷效能 妊娠期高血壓疾病患者血清miR-146a和miR-25表達(dá)及CysC水平在檢測腎功能損害方面具有較高的靈敏度和特異性，將3個(gè)指標(biāo)是否有腎功能損害在通過二元回歸分析，聯(lián)合指標(biāo)(miR-146a+miR-25+CysC)具有明顯的線性關(guān)系，得回歸方程8.835 XmiR-146a-15.360miR-25+16.357CyC-13.372，并發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測的曲線下面積為0.971，靈敏度為92.3%，特異度97.3%，在診斷腎功能損害方面明顯優(yōu)于單獨(dú)miR-146a(Z=2.342，P=0.019)，miR-25(Z=2.210，P=0.034)和CysC(Z=2.919，P=0.004)，而3個(gè)指標(biāo)之間的曲線下面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4，圖1。

表4 聯(lián)合血清miR-146a、miR-25和CyC水平妊娠期高血壓疾病腎功能損害的診斷效能

圖1 聯(lián)合血清miR-146a、miR-25和CysC水平妊娠期高血壓疾病腎功能損害的曲線下面積

3 討論

妊娠期高血壓疾病主要以高血壓和蛋白尿?yàn)榕R床表現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，高血壓最早易受攻擊的靶器官是腎臟，現(xiàn)有研究認(rèn)為妊娠期高血壓時(shí)，全身血管廣泛痙攣，導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，腎血管痙攣，腎臟血流量明顯降低，腎小球?yàn)V過率明顯降低，出現(xiàn)血清肌酐升高，出現(xiàn)腎功能受到損害[9]。臨床上診斷腎功能損傷的指標(biāo)是血清肌酐，但其濃度受到多種因素的影響，對(duì)腎小球的損傷并不特別敏感，尤其輕度受到損傷，血清肌酐仍在正常范圍。本研究發(fā)現(xiàn)妊娠期高血壓疾病患者血清CysC水平明顯高于正常妊娠組和健康對(duì)照組，并且隨著妊娠期高血壓疾病嚴(yán)重程度升高而升高，說明CysC與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定的關(guān)系，同時(shí)本研究還顯示CysC水平在腎功能異常組明顯腎功能正常組，并其通過受試者曲線分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清濃度>1.29 mg/L，其靈敏度為87.2%，特異性為81.1%，說明CysC能夠明顯反映妊娠期高血壓患者腎功能的損害程度，與文獻(xiàn)報(bào)道[9，10]一致。CysC是一種堿性的小分子蛋白質(zhì)，共120個(gè)氨基酸，在體內(nèi)濃度十分穩(wěn)定，不受飲食，機(jī)體炎性和腫瘤等其他因素的影響[11]。而腎臟是清除CysC的唯一器官，并且其濃度與腎小球?yàn)V過率密切相關(guān)，與腎臟損傷程度呈正相關(guān)，現(xiàn)已經(jīng)運(yùn)用監(jiān)測早期腎功能損傷，有助于早期做出干預(yù)措施，防止并發(fā)癥的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期高血壓疾病患者血清miR-146a表達(dá)水平明顯高于正常妊娠組，并且隨著疾病嚴(yán)重程度的增加而增加，說明基因miR-146a參與了妊娠期高血壓疾病的發(fā)病過程。同時(shí)本組研究發(fā)現(xiàn)腎功能損害患者血清miR-146a水平明顯高于腎功能正?；颊撸f明miR-146a參與了腎臟損傷的過程，本組研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清相對(duì)表達(dá)量2.32時(shí)，在診斷腎功能損害方面具有較高靈敏度和特異性。miR-146a定位人類染色體5q34位點(diǎn)上，是一種多靶向基因調(diào)節(jié)器[12]?，F(xiàn)有研究證實(shí)其參與了動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展過程，是急性冠脈綜合征的重要危險(xiǎn)因素，是評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化程度的重要指標(biāo)，是急性冠脈綜合征病情評(píng)估的指標(biāo)[13，14]。有研究顯示miR-146a參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程，與參與了炎性反應(yīng)和腎臟氧化應(yīng)激損傷，是反映腎臟功能損害的有用指標(biāo)[15]。

本研究還發(fā)現(xiàn)妊娠期高血壓患者血清miR-25表達(dá)水平明顯低于正常妊娠組和健康對(duì)照組，并且與妊娠期高血壓疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，說明miR-25是妊娠高血壓疾病的保護(hù)因子，參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過程。本研究還發(fā)現(xiàn)腎功能異常的妊娠期高血壓疾病患者血清miR-25表達(dá)水平明顯低于腎功能正常組，在預(yù)測腎功能異常方面具有較高的特異性和靈敏度?，F(xiàn)已知miR-25是屬于miR-106 b-25家族，定位于7 q22.1染色體上，維持蛋白7基因內(nèi)含子上。有研究證實(shí)miR-25在腫瘤組織中具有明顯表達(dá)，并在不同的腫瘤具有不同的功能[16]，而糖尿病合并腎臟損傷方面的研究發(fā)現(xiàn)miR-25主要通過對(duì)絲裂原活化蛋白激酶激酶4進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)到對(duì)糖尿病腎病纖維化具有明顯的抑制作用[17]，而在妊娠期高血壓合并腎臟損傷方面未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)miR-25表達(dá)與miR-146a表達(dá)和CysC水平呈負(fù)相關(guān)，而miR-146a表達(dá)與CysC水平呈正相關(guān)，說明miR-25和miR-146a與CysC具有一定的聯(lián)系，而miR-25與miR-146a呈負(fù)相關(guān)，可能內(nèi)在存在某種平衡其具體引起妊娠高血壓腎臟損傷的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)通過3個(gè)指標(biāo)是否有腎功能損害在通過二元回歸分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合指標(biāo)具有明顯的線性關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測的曲線下面積為0.971，靈敏度為92.3%，特異度為97.3%，在診斷腎功能損害方面明顯優(yōu)于單獨(dú)miR-146a、miR-25和CysC，而3個(gè)指標(biāo)之間的曲線下面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明3個(gè)指標(biāo)在檢測妊娠期高血壓腎病方面具有一定的特異性和靈敏度，聯(lián)合檢測能夠進(jìn)一步提高其靈敏度和特異性，并且其曲線下的面積進(jìn)一步提高，當(dāng)妊娠高血壓患者血清相對(duì)表達(dá)量miR-146a>2.32和CysC>1.29 mg/L而miR-25≤1.02時(shí)，患者在診斷妊娠高血壓合并腎功能損害具有較高的特異性和靈敏度，對(duì)這些患者早期采取干預(yù)措施，進(jìn)而降低妊娠高血壓疾病患者的不良預(yù)后。

綜上所述，miR-146a和miR-25參與了妊娠期高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展，聯(lián)合檢測miR-146a、miR-25和CysC水平在預(yù)測妊娠期高血壓疾病患者腎功能損害具有重要的臨床價(jià)值。