孫婧陶，郝耘初，張文涵，朱彥龍，王張鈺，金君學(xué)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

我國(guó)是豬肉產(chǎn)業(yè)大國(guó)，豬是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，并且豬在解剖學(xué)、生理學(xué)、遺傳背景及疾病特征等方面與人類(lèi)相似，被認(rèn)為是人體異種器官來(lái)源的首選動(dòng)物，因此豬在生物醫(yī)學(xué)研究中是重要的模式動(dòng)物[1]。體外生產(chǎn)技術(shù)和基因編輯技術(shù)的有效結(jié)合不僅促進(jìn)了胚胎工程的發(fā)展及應(yīng)用，而且?guī)?dòng)了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。胚胎體外生產(chǎn)（In Vitro Production，IVP）需要大量高質(zhì)量的卵母細(xì)胞。相較體內(nèi)環(huán)境而言，體外發(fā)育的卵母細(xì)胞及早期胚胎發(fā)育能力更易受到影響，這很可能是活性氧（ROS）引起的氧化應(yīng)激造成了胚胎細(xì)胞凋亡或永久性發(fā)育阻滯[2-3]。為提高卵母細(xì)胞體外成熟率和胚胎體外發(fā)育率，研究者在卵母細(xì)胞體外成熟體系中添加維生素[4]、亞硒酸鈉[5]、白藜蘆醇[6]、褪黑素[7]等抗氧化劑。其中，褪黑素作為抗氧化劑在人體中廣泛分布，但半衰期過(guò)短[8]。褪黑素受體（MT）是一類(lèi)G 蛋白偶連受體[9]，在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的亞型為MT1 和MT2[10]。雷美替胺是一種MT1 和MT2 受體激動(dòng)劑，比褪黑素有更長(zhǎng)的半衰期，且親和性高于褪黑素[11]。目前，尚無(wú)在豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中添加褪黑素受體激動(dòng)劑雷美替胺的研究。因此，本研究旨在探究不同濃度雷美替胺對(duì)豬卵丘細(xì)胞擴(kuò)增、卵母細(xì)胞體外成熟（In Vitro Maturation，IVM）及胞質(zhì)內(nèi)谷胱甘肽（GSH）和ROS 水平、孤雌胚胎發(fā)育能力及胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究所有實(shí)驗(yàn)試劑均購(gòu)置于Sigma（美國(guó)）公司，特殊說(shuō)明的除外。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng) 從屠宰場(chǎng)獲得豬卵巢，放于28～35℃生理鹽水中，2 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用18 號(hào)針頭抽取直徑為3～6 mm 的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus-oocyte Complexs，COCs）。隨后將COCs轉(zhuǎn)移至IVM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)21 h，然后再轉(zhuǎn)移至無(wú)激素的IVM 培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)21 h。礦物油覆蓋在4 孔板的IVM 培養(yǎng)液中，并在38.5℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。

IVM 培養(yǎng)液采用TCM-199（Invitrogen）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加0.6 mmol/L 半胱氨酸、0.91 mmol/L丙酮酸鈉、5 μL/mL 的 ITS-A（100X）（Invitrogen）、10 ng/mL EGF、10%豬卵泡液、10 IU/mL PMSG、10 IU/mL hCG、1% 青 鏈 霉 素（Invitrogen）。 在 IVM 培 養(yǎng) 液中，分別添加10-11、10-9、10-7、10-5mol/L 的雷美替胺（APExBIO）作為處理組，不添加雷美替胺組作為對(duì)照組，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 豬卵丘細(xì)胞擴(kuò)散程度判定和分級(jí) 卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散情況進(jìn)行評(píng)估[12-13]：0 級(jí)，卵丘細(xì)胞無(wú)任何擴(kuò)散；1 級(jí)，只有卵丘細(xì)胞最外層稍有擴(kuò)散；2 級(jí)，外層的卵丘細(xì)胞擴(kuò)散；3 級(jí)，除放射冠外，其余卵丘細(xì)胞均擴(kuò)散；4 級(jí)，包括放射冠在內(nèi)的所有卵丘細(xì)胞均實(shí)現(xiàn)了最大程度的擴(kuò)散。統(tǒng)計(jì)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散指數(shù)（Cumulus Expansion Index，CEI），即計(jì)算各級(jí)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散的加權(quán)算術(shù)平均數(shù)，用于衡量卵丘細(xì)胞擴(kuò)散的指標(biāo)。

1.2.3 豬卵母細(xì)胞ROS、GSH 染色 觀察成熟豬卵母細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和GSH 水平，分別使用H2DCFDA（2’，7’-dichlorodihdrofluorescein diacetate，Invitrogen) 和CellTracker Blue CMF2HC（4-chloromethy -6.8-difluoro-7-hydroxycoumarin，Invitrogen）染色，前者為綠色熒光，后者為藍(lán)色熒光。在PBS 中分別添加10 μmol/L的H2DCFDA 和CellTracker Blue CMF2HC，將卵母細(xì)胞放于其中避光培養(yǎng)30 min。用PBS 洗滌3 次，置于4 μL 的TALP-HEPES 小滴中，在熒光顯微鏡下觀察熒光（TE2000-S，Nikon），使用Image J 軟件對(duì)ROS 和GSH 熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，P＜0.05 表示差異顯著。

1.2.4 豬卵母細(xì)胞孤雌激活（Parthenogenetic Activation，PA） 將經(jīng)0.1%透明質(zhì)酸酶洗脫后的成熟卵置于激活液（0.28 mol/L 甘露醇、0.1 mmol/L CaCl2、0.1 mmol/L MgSO4、0.5 mmol/L HEPES）中，使用BTX ECM 2001激活，激活條件為1.5 kV/cm 的直流脈沖60 μs。激活后的卵母細(xì)胞放于PZM-5（Funakoshi Corporation）培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h 評(píng)估胚胎卵裂率，168 h 后評(píng)估囊胚率；并用Hoechst 33342 對(duì)囊胚進(jìn)行染色，統(tǒng)計(jì)囊胚總細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)10-11mol/L 雷美替胺處理組和對(duì)照組的孤雌囊胚進(jìn)行胚胎發(fā)育相關(guān)基因mRNA 表達(dá)情況分析?？俁NA 提取使用TRIzol Reagent（Invitrogen），具體方法參照說(shuō)明書(shū)?？俁NA 濃度及純度使用Nano Drop 2000 分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行定量。使用Clontech 試劑盒（TaKaRa）將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系20 μL：1 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL (10 pmol/μL)，10 μL SYBR Green Premix Ex Taq，8.2 μL NFW。反應(yīng)條件：95 ℃變性 30 s、退火20 s、72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1，GAPDH 為看家基因。實(shí)施熒光定量PCR 結(jié)果采用 2-△△Ct法。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0 通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）和Tukey 檢驗(yàn)（Tukey’s test）進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示。基因表達(dá)差異使用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析。P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的雷美替胺對(duì)豬卵丘細(xì)胞擴(kuò)散的影響 由表2 可知，10-11、10-9mol/L 雷美替胺處理組卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散指數(shù)顯著高于對(duì)照組。

2.2 不同濃度的雷美替胺對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響 如表3 所示，不同處理組的卵母細(xì)胞成熟率為76.3%～87.7%，所有組別之間沒(méi)有顯著性差異。

2.3 不同濃度的雷美替胺對(duì)豬卵母細(xì)胞內(nèi)GSH 和ROS的影響 如圖1 所示，雷美替胺處理組GSH 熒光強(qiáng)度均顯著高于對(duì)照組，ROS 熒光強(qiáng)度均顯著低于對(duì)照組。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列

表2 不同濃度的雷美替胺對(duì)豬卵丘細(xì)胞擴(kuò)散的影響

表3 不同濃度的雷美替胺對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟率的影響

圖1 不同濃度的雷美替胺對(duì)豬卵母細(xì)胞內(nèi)GSH 和ROS熒光強(qiáng)度分析

2.4 不同濃度的雷美替胺對(duì)豬孤雌胚胎發(fā)育能力的影響 由表4 可知，各組在卵裂率上無(wú)顯著性差異；10-11mol/L處理組的囊胚率顯著高于對(duì)照組；10-11mol/L 和10-9mol/L處理組囊胚總細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組。

2.5 雷美替胺對(duì)胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響 熒光定量PCR 結(jié)果顯示（圖2），10-11mol/L 組的孤雌囊胚中POU5F1、NANOG和SOX2的 mRNA 表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，與DNA 甲基化相關(guān)的DNMT3a和DNMT3b基因mRNA 表達(dá)量無(wú)顯著性差異。

3 討 論

在畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域中，卵母細(xì)胞體外成熟已成為現(xiàn)代胚胎生物技術(shù)的重要內(nèi)容之一，是體外受精、核移植等生物技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。COCs 是由卵母細(xì)胞和其周?chē)穆亚鸺?xì)胞組成，卵丘細(xì)胞在其生長(zhǎng)和成熟過(guò)程中與卵母細(xì)胞在生理和代謝上結(jié)合，并參與排卵和受精。在卵泡生長(zhǎng)過(guò)程中，卵丘細(xì)胞通過(guò)縫隙連接與卵母細(xì)胞緊密相連，縫隙連接允許雙向旁分泌，從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑和卵母細(xì)胞中RNA 合成等過(guò)程[14]。此外，卵丘細(xì)胞還參與抗氧化和代謝過(guò)程并提供脂肪酸、碳水化合物和氨基酸等能量底物給卵母細(xì)胞，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞發(fā)育[15]。因此，卵丘細(xì)胞對(duì)于卵母細(xì)胞的發(fā)育十分重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10-11mol/L 和10-9mol/L 雷美替胺處理組的卵丘細(xì)胞擴(kuò)散指數(shù)顯著高于對(duì)照組。由此推斷，10-11mol/L和10-9mol/L 雷美替胺處理組的卵母細(xì)胞發(fā)育能力高。隨后本實(shí)驗(yàn)對(duì)卵母細(xì)胞成熟率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)各處理組無(wú)顯著性差異。由以上結(jié)果可知，卵丘細(xì)胞擴(kuò)散程度的好壞與卵母細(xì)胞核成熟無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，有可能與卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟有關(guān)。目前眾多學(xué)者認(rèn)為，卵母細(xì)胞體外成熟后的GSH水平是標(biāo)志卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的重要指標(biāo)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，添加雷美替胺使卵母細(xì)胞內(nèi)GSH 水平顯著升高，ROS 水平顯著降低，也證實(shí)雷美替胺促進(jìn)了豬卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟，與雷美替胺能顯著降低卵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)。

雷美替胺是一種褪黑素受體激動(dòng)劑，對(duì)MT1 和MT2 受體有較強(qiáng)親和力和內(nèi)在活性，能通過(guò)受體興奮發(fā)揮最大的效應(yīng)。前期研究表明，褪黑素在小鼠[18]、綿羊[19]、牛[20]等哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育方面均有促進(jìn)作用。在豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中添加褪黑素，雖然未提高卵母細(xì)胞成熟率，但GSH 水平得到提升，同時(shí)增加了豬囊胚率及囊胚細(xì)胞數(shù)[21]。本實(shí)驗(yàn)中，雷美替胺能夠通過(guò)促進(jìn)胞質(zhì)成熟，提高囊胚發(fā)育能力及囊胚質(zhì)量。另外，前期研究也發(fā)現(xiàn)，在豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中添加10-9mol/L 褪黑素，可提高囊胚發(fā)育能力[22]，而在本研究中低濃度的褪黑素受體激動(dòng)劑雷美替胺（10-11mol/L）與高濃度的褪黑素（10-9mol/L）處理結(jié)果極為相似，這很可能與雷美替胺的親和性比褪黑素更高有關(guān)。

表4 不同濃度的雷美替胺對(duì)豬孤雌胚胎發(fā)育能力的影響

圖2 雷美替胺對(duì)胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)影響

轉(zhuǎn)錄因子POU5F1和NANOG基因在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中表達(dá)，并維持多能性。但是在豬囊胚中，POU5F1基因在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層中均表達(dá)[23]。SOX2基因與POU5F1基因協(xié)同調(diào)節(jié)，來(lái)維持胚胎多能干細(xì)胞的表型[24]。胚胎中多能性因子的表達(dá)情況是衡量胚胎體外發(fā)育質(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果證實(shí)，10-11mol/L 組的孤雌囊胚中POU5F1、NANOG和SOX2的 mRNA 表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)條件下，在豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中，添加10-11mol/L 的雷美替胺使卵丘細(xì)胞擴(kuò)散和卵母細(xì)胞內(nèi)GSH 表達(dá)水平提升，ROS 表達(dá)水平降低，從而提高了豬卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育能力。