蔣云芳，趙彩嬌，韋日鋪，黃逸珠，盧美靜

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

人口老齡化是個日益嚴(yán)峻的社會問題，許多與衰老早期相關(guān)的疾病如心臟病、高血壓、腦梗塞等心血管疾病及阿爾茨海默、帕金森等神經(jīng)退行性變疾病的發(fā)病率在逐年增長，這些與增齡相關(guān)的疾病不僅會加速衰老的進(jìn)程，也使老年人的生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，給家庭與社會帶來極大的負(fù)擔(dān)。晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advance dglycation end products，AGEs)是體內(nèi)生物大分子(蛋白、核酸等)與糖非酶促反應(yīng)的最終產(chǎn)物，它的存在與衰老及衰老早期疾病有著密切聯(lián)系，是衰老的重要生物學(xué)標(biāo)志[1]。艾灸療法具有操作簡便、安全可靠、效果顯著、無或少副作用、費(fèi)用經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢，查閱古今文獻(xiàn)可知艾灸的干預(yù)能夠延緩衰老，但其延緩衰老的機(jī)制有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。故本實(shí)驗(yàn)以D-半乳糖致大鼠衰老模型為研究對象，選取命門穴進(jìn)行艾炷灸干預(yù)，應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的蛋白組學(xué)技術(shù)檢測，觀察大鼠腦組織中AGES、受體RAGE及RAGE mRNA表達(dá)水平影響，探討艾炷灸延緩衰老的機(jī)制，進(jìn)一步為艾炷灸命門穴延緩衰老提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)采用健康SD雄性大鼠共40 只，月齡在42～49天，體質(zhì)量200～250 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證編號為：SCXK(湘)2016-0002。將所有大鼠放在每天光照與黑暗各12 h(光照時間為7:00—19:00)、室溫18～22℃的實(shí)驗(yàn)室條件下，進(jìn)行飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間給大鼠自由進(jìn)食和自由飲水。在實(shí)驗(yàn)的過程中，遵照國家科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的要求對動物進(jìn)行處置。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

D-半乳糖(Sigma公司)；膜蛋白、核蛋白和胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(上海生工，Cat. C510002)；Rat Advanced Glycation End Products (AGEs) ELISA Kit(武漢華美生物工程有限公司)；Rat advanced glycosylation end product-specific receptor (AGER)ELISA Kit(武漢華美生物工程有限公司)；艾炷采用艾絨(豐陽艾條公司)制成，制作方法：將艾絨捻成直徑約3 mm、高6 mm的艾炷，每個艾炷稱為1壯，質(zhì)量約30 mg/壯。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

Centrifuge 5810R離心機(jī)(德國 Eppendorf 公司)；MDF-H73865 醫(yī)用低溫箱(-80℃)(日本三洋電機(jī)株式會社)；BCD-210DCM 冰箱(青島海爾股份有限公司)；TissueLyser LT勻漿儀(Qiagen，GER)；微量移液器(德國 Eppendorf 公司產(chǎn)品)；SW-CJ-IFD 潔凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品)；DHG-9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(海鴻都電子科技有限公司產(chǎn)品)；FA2204B電子秤(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品)。

1.4 動物分組

將所有健康雄性SD大鼠(共40只)進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，1周后隨機(jī)分組，其中A組(空白組)10只、剩余30只大鼠均用于制備衰老模型，模型制備成功后隨機(jī)選取20只大鼠分為B組(模型對照組)、C組(命門穴治療組),每組各10只。

1.5 衰老大鼠模型的建立

大鼠造模參照崔氏[2]造模的方法，模型制備組采用D-半乳糖溶液(按照1g D-半乳糖加入10 mL生理鹽水的比例配備D-半乳糖溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用)進(jìn)行腹腔注射造模，每天注射1次，注射劑量參照大鼠的體重而定，標(biāo)準(zhǔn)為500 mg/kg。連續(xù)造模60天后，若大鼠出現(xiàn)明顯的亞急性衰老癥狀，如精神萎靡不振、進(jìn)食減少、肢體溫度偏低、形體趨向于臃腫、行動反應(yīng)遲緩、皮膚松弛缺乏彈性、毛色枯黃無澤等,提示模型制備成功。

1.6 處理方法

1.6.1 A組(空白組) 每日空腹稱體質(zhì)量，腹腔注射同體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)60天。

1.6.2 模型制備大鼠 每日空腹稱體質(zhì)量，秤質(zhì)量后進(jìn)行腹腔注射制備成亞急性衰老模型。模型制備成功后隨機(jī)選取20只大鼠分為B組(模型對照組)、C組(命門穴治療組),每組各10只。

1.6.3 造模后處置 A組(空白組)：繼續(xù)正常喂養(yǎng)，不作其他處理。B組(模型對照組)：繼續(xù)正常喂養(yǎng)，不作其他處理。C組(命門穴治療組)：采用艾炷灸命門穴進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)者一人左手拇指和食指抓住大鼠頸部皮膚，使大鼠呈俯臥位，右手固定大鼠一邊大腿及尾部，另一人固定另一邊大腿并進(jìn)行治療操作，命門穴的定位參照黃氏選穴方法[3]選取。施灸前先剪去施灸部位的體毛，然后再用少量蘆薈汁涂抹，將艾炷安放固定好后，用線香點(diǎn)燃艾炷進(jìn)行無瘢痕直接灸，當(dāng)大鼠出現(xiàn)肢體扭動、劇烈掙扎時迅速用鑷子移走艾炷，每次連續(xù)灸3壯，每日1次，共4周。

1.7 標(biāo)本采集

各組大鼠水迷宮結(jié)束后第2天開始采集標(biāo)本，采集標(biāo)本前禁食12 h，大鼠麻醉后處死立即于冰臺上快速取腦組織，用勻漿儀制備腦勻漿，放入-80℃冰箱貯存。

1.8 觀察指標(biāo)測定

1.8.1 大鼠行為學(xué)檢測 全部組在治療結(jié)束后第1天開始采用Morris水迷宮檢測法[4]進(jìn)行水迷宮測試。檢測前先在水池中放置平臺，平臺置于某一象限的中間，然后往池中注入清水，至水面高出平臺2 cm為止，水溫控制在(21.0±1.5)℃左右，將大鼠面向池壁放入水中，4個象限中的任一象限均可作為入水點(diǎn)，4個象限依次放入，大鼠在水中游泳時會主動尋找并爬上平臺，其所需的時間即稱為潛伏期，觀察并記錄潛伏期的時間長短作為學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。將大鼠每次入水的最長游泳時限設(shè)定為60 s，如果大鼠在60 s內(nèi)未能在水中找到平臺則將潛伏期記為60 s，這時需將其引至平臺并停留10 s，以強(qiáng)化大鼠對平臺的記憶能力，每天訓(xùn)練1次，在經(jīng)過連續(xù)5天的訓(xùn)練后于第6天撤除平臺，將大鼠放入水中游泳，入水點(diǎn)同上，觀察記錄120 s內(nèi)大鼠跨越平臺相應(yīng)位置的次數(shù)，數(shù)值越高說明其空間探索能力越強(qiáng)。

1.8.2 酶聯(lián)免疫吸附測定法 測定大鼠腦組織勻漿中晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)，采用雙抗體夾心法測定。嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.8.3 RT-PCR 測定腦組織中RAGE mRNA：使用RNAprep pure Tissue Kit 提取組織總RNA，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成預(yù)混Mix合成第一鏈cDNA，嚴(yán)格按照試劑盒執(zhí)行，目的基因RAGE與內(nèi)參基因β-actin的引物序列為：Forward Primer(5′→3′)CCCAATGGTTCACTCCTCCTT，Reverse Primer(5′→3′)CACCGGAAAGTCCCCTCAT；每個PCR反應(yīng)體系包括：2×12.5 μlTalent qPCR PreMix 、上、下游引物各0.75 μL、1 μLcDNA、11 μLddH2O ，采用相對定量ΔΔCT法，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸32 s，40個循環(huán)；PCR反應(yīng)結(jié)束后繪制熔解曲線。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)的表達(dá)情況

結(jié)果顯示,模型對照組與空白組比較，模型對照組比空白組大鼠找到平臺的潛伏期時間延長，穿越平臺的次數(shù)減少,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。命門穴治療組與模型對照組比較，命門穴治療組大鼠找到平臺的潛伏期時間減少、穿越平臺的次數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。見表1～2。

表1 水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組大鼠定位航行潛伏期比較

注：與空白組比較，※P<0.05，※※P<0.01；與模型對照組比較，★P<0.05，★★P<0.01。

表2 水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組大鼠空間探索能力情況

注：與空白組比較，※P<0.05，※※P<0.01；與模型對照組比較，★P<0.05，★★P<0.01。

2.2 大鼠腦組織中AGEs、RAGE表達(dá)情況

結(jié)果可知,模型對照組與空白組相比，模型對照組大鼠腦組織勻漿中AGEs、RAGE表達(dá)水平明顯升高，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；命門穴治療組和模型對照組比較，命門穴治療組大鼠腦組織勻漿中AGEs、RAGE表達(dá)水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織中AGEs、RAGE表達(dá)情況

注：與空白組比較，※P<0.05，※※P<0.01；與模型對照組比較，★P<0.05，★★P<0.01。

2.3 大鼠腦組織中RAGE mRNA表達(dá)情況

結(jié)果可知，模型對照組與空白組相比，模型對照組大鼠腦組織勻漿中RAGE mRNA表達(dá)水平明顯升高，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；命門穴治療組和模型對照組比較，命門穴治療組大鼠腦組織勻漿中RAGE mRNA表達(dá)水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠腦組織中RAGE mRNA表達(dá)情況

注：與空白組比較，※P<0.05，※※P<0.01；與模型對照組比較，★P<0.05，★★P<0.01。

3 討論

艾灸作為中醫(yī)學(xué)的重要組成部分，在延緩衰老、防病保健中發(fā)揮著重要的作用。命門穴是艾灸延衰保健最重要的穴位之一，其位于第2腰椎棘突下凹陷處；命門中的命即指生命，門則指出入通達(dá)之處，故命門穴寓含的意思是生命本源的動力出入通達(dá)與維系生命的地方。命門與腎有密切的聯(lián)系，《針灸問答·奇經(jīng)八脈解說》曰:“再上十四椎，當(dāng)腎正中，為命門穴，乃腎系著脊之處，為督脈之主。”《勉學(xué)堂針灸集成 》中記載命門穴主治“腦虛,旋仆,善忘……”。即說明命門穴有防治腦衰老的作用。命門是對能調(diào)控五臟機(jī)能的先天精氣的概括，而命門穴是命門在人體體表的門戶，通過艾灸刺激命門穴能激發(fā)先天元?dú)?，溫煦命門相火[5]。《難經(jīng)·第三十六難》謂:“腎兩者，皆非腎……右者為命門?！泵T是生命之原，是精神之所舍,原氣之所系，是男子藏精、女子系胞之處。明代張介賓曰:“命門為元?dú)庵?水火之宅,五臟之陰氣非此不能滋,五臟之陽氣非此不能發(fā)?！壁w獻(xiàn)可也認(rèn)為命門之火是十二官的功能活動的原動力。綜合以上醫(yī)家的論述研究可知命門之火是生命的原動力，“命門火衰”即是衰老的主要原因，而通過艾灸命門穴，能夠溫陽助火，鼓動腎間之動氣，化生氣血而溫煦滋養(yǎng)全身，延緩衰老[6]。張燕等在基因調(diào)控層次上研究艾灸命門穴對炎性衰老的影響，發(fā)現(xiàn)22條與衰老相關(guān)的炎性反應(yīng)基因,在艾灸命門穴后，有19條基因的表達(dá)在治療后總體趨向正常，說明艾灸命門穴能調(diào)控炎性基因表達(dá)而起到抑制衰老的作用[7]。這也是本實(shí)驗(yàn)選用命門穴作為干預(yù)手段的依據(jù)。

AGEs與衰老及衰老早期疾病有著密切的聯(lián)系，在生理?xiàng)l件下，人體體內(nèi)生物大分子與還原糖在無酶條件下進(jìn)行無酶縮合反應(yīng)，最終形成穩(wěn)定不可逆交聯(lián)體，即晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)[8]。AGEs可隨著年齡的增長在人體各組織器官不斷堆積，導(dǎo)致細(xì)胞組織器官的不斷損傷，最終加速衰老的形成[9]；研究證明[10]AGEs與衰老及糖尿病、動脈硬化、阿爾茨海默病、白內(nèi)障等增齡性疾病有著密切的關(guān)系；而D-半乳糖作為還原糖中的醛糖，長期注射可以產(chǎn)生大量的AGEs，如郭妍等[11]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),D-半乳糖衰老模型與自然衰老大鼠心肌內(nèi)AGEs含量均高于成年對照組。熊愛華等[12]也證實(shí)D-半乳糖衰老模型的腦組織中會產(chǎn)生大量的AGEs,可降低腦組織中抗氧化能力及引起胞質(zhì)[Ca2+]超負(fù)荷，出現(xiàn)腦細(xì)胞內(nèi)線粒體的損傷引起衰老。由此可推測D-半乳糖所致衰老模型從AGEs的生成方面是有別于其他衰老模型的。如本研究中模型對照組大鼠腦組織中AGEs表達(dá)增加，此結(jié)論與上述情況相符。

AGEs的致病途徑分為直接與間接兩個方面，AGEs可直接修飾蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞原有的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致機(jī)體損傷,加速機(jī)體衰老進(jìn)程；也可通過與存在于細(xì)胞表面的特異性受體RAGE相互作用，引發(fā)一系列的生物學(xué)效應(yīng)而致衰老[13]。RAGE作為AGEs最重要的受體，AGEs的許多功能是通過與位于細(xì)胞表面的特異性受體RAGE相互作用所致[14]。AGEs與細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后，可生成大量的氧自由基，激活炎癥開關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-kB，使NF-kB核內(nèi)移，介導(dǎo)NF-kB炎癥通路，并誘導(dǎo)產(chǎn)生多種損傷因子，導(dǎo)致細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)的異常，引起機(jī)體損傷，導(dǎo)致衰老加速[15]。AGEs需要受體RAGE降解，故AGEs的大量產(chǎn)生能誘導(dǎo)RAGE表達(dá)水平的上調(diào)，本研究結(jié)果顯示,模型對照組大鼠腦組織中的RAGE及RAGE mRNA表達(dá)較空白組水平升高。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖致衰老模型大鼠作為研究對象，選取命門穴進(jìn)行艾炷灸干預(yù)，觀察大鼠腦組織中AGES、RAGE及RAGE mRNA表達(dá)水平影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示艾炷灸命門穴可以下調(diào)D-半乳糖衰老模型大鼠腦組織中上述指標(biāo)的表達(dá)水平，說明艾炷灸命門穴可以延緩衰老，其機(jī)制可能是AGEs的水平下調(diào)減少了對蛋白的直接修飾及抑制AGEs與特異性配體RAGE結(jié)合而引發(fā)一系列的生物學(xué)效應(yīng)而達(dá)到延緩衰老的目的。

衰老常伴有學(xué)習(xí)及記憶力下降等表現(xiàn)，因此在檢測大鼠腦組織中的指標(biāo)前采用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)評價衰老大鼠學(xué)習(xí)及空間記憶能力，本研究結(jié)果顯示,D-半乳糖致衰老大鼠會出現(xiàn)記憶力減退和空間認(rèn)知障礙，而命門穴治療組較模型對照組大鼠找到平臺的潛伏期時間減少，穿越平臺的次數(shù)增多，說明艾炷灸命門可以改善D-半乳糖衰老大鼠的學(xué)習(xí)及空間記憶力。

衰老的機(jī)制是多方面、多層次的，AGEs與衰老的關(guān)系早已被證實(shí)，而本實(shí)驗(yàn)研究首次驗(yàn)證艾炷灸命門穴可以下調(diào)AGEs表達(dá)水平來延緩衰老，不僅為艾炷灸延緩衰老提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也提示了AGEs與多種增齡相關(guān)性疾病密切相關(guān)，那么艾炷灸命門穴是否也能減少相關(guān)增齡性疾病的發(fā)生及發(fā)展,例如防治糖尿病、動脈硬化等,這有待于進(jìn)一步的研究論證。