李 杰，任航行，王高富，蔣 婧,孫曉燕，周 鵬

(重慶市畜牧科學院草食牲畜研究所，重慶 榮昌 402460)

【研究意義】骨骼肌的形成是一個高度復雜且有序的生物學過程，主要包括成肌決定，成肌細胞增殖，細胞周期的退出，肌肉特異性基因的表達，肌細胞融合形成多核肌管，多核肌管再經(jīng)過一系列發(fā)育變化, 最后分化成為具有功能的成熟肌纖維[1-2]。這些復雜過程的順利進行不僅受許多編碼蛋白的因子調節(jié)，如成肌調節(jié)因子家族(MRFs)，肌細胞增強子因子2家族(MEF2)和對框基因(Pax)家族，而且還受到非編碼RNAs的調控，如microRNAs (miRNAs)。【前人研究進展】miRNAs 是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼小分子 RNA，長約22nt(核苷酸)，通過與靶mRNA特異性的堿基互補配對，引起靶mRNA降解、穩(wěn)定性下降或者抑制其翻譯，從而調控基因的轉錄后表達水平[3]。研究表明，miRNAs參與了增殖、分化、凋亡、發(fā)育從細胞到個體的整個生命過程及腫瘤發(fā)生過程[4]。miR-665，miR-127-3p/5p，miR-136-3p/5p, miR-432-3p/5p和miR-433同位于山羊21號染色體，形成一個特殊的miRNA簇。筆者前期用高通量測序(RNA-Seq)法對Texel 羊(MSTN突變型)與烏珠穆沁羊(MSTN野生型)胎兒骨骼肌miRNA進行轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)miR-127-3p與miR-1/206/133在兩品種羊骨骼肌中在骨骼肌高表達miRNAs，且miR-127-3p在2個品種羊骨骼肌中差異表達[5]。Li 等的研究發(fā)現(xiàn)miR-127-3p在波爾山羊肌肉組織表達量高于巫山黑山羊，同時miR-127-3p 在增殖的C2C12細胞的表達量高于分化時期的細胞[6]。【本研究切入點】而位于同一個miRNA簇的miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433在山羊組織和細胞的表達模式目前尚未見相關的文獻報道。本研究首先以波爾山羊體組織為試驗材料，檢測在不同組織中miRNA簇基因(miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)的表達情況，接著分別檢測C2C12細胞增殖與分化不同生肌時間點第0、2、4、6、8 天中miRNA簇基因動態(tài)表達模式?！緮M解決的關鍵問題】為闡明miRNA簇基因在骨骼肌的生長發(fā)育的調控作用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在巫山縣振興農(nóng)牧科技開發(fā)有限公司隨機選取3只成年的波爾山羊，屠宰后立即采集樣品，DEPC水清洗后裝管置于液氮中，用于肌肉組織RNA提取。C2C12細胞為本實驗室保存。TRIzol Reagent購自invitrogen公司(美國)；miScript Π RT Kit與miScript SYBR Green PCR Kit 均購自QIAGEN公司(德國)；DMEM培養(yǎng)基購自gibco公司(北京)；胎牛血清(FBS)、馬血清(HS)和青鏈霉素購自HyClone公司(新西蘭)；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)

C2C12細胞生長培養(yǎng)基(GM)為含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。當細胞融合度達到85 %左右時更換為分化培養(yǎng)基(DM)為含2 %馬血清的DMEM培養(yǎng)基，GE和DM中均需均加入1 %的雙抗, 隔天更換一次培養(yǎng)基。分別在增殖和分化階段的0、2、4、6、8 d收集細胞，用于提取細胞的miRNA。

1.3 miRNA的提取與反轉錄

組織提前用液氮充分研磨，細胞吸棄培養(yǎng)基后，用PBS清洗2～3次，加入 TRIzol 提取 RNA。組織和細胞的總RNA按照TRIzol Reagent(Invitrogen，美國)提取試劑盒的操作步驟提取。RNA完整性用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，濃度和純度采用 NanoDrop 2000 超微量分光光度計(Thermo，美國) 檢測。經(jīng)檢測完整性良好的RNA用miScript Π RT Kit(QIAGEN，德國)反轉錄合成cDNA。其中反應體系為 20 μl，包含3 μl(400 ng/μl)，5×miScript HiSpec Buffer 4 μl，10×miScript Nucleics Mix 2 μl，miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μl，RNase ddH2O 9 μl。合成產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆?表1)。

表1 miRNA 簇基因引物序列信息Table 1 Primer information of miRNA cluster genes

1.4 RT-qPCR

按照miScript SYBR Green PCR Kit(QIAGEN, 德國)試劑盒說明書，對組織與細胞進行熒光定量檢測分析，U6作為內參基因。反應體系(20 μl)：模板cDNA 1 μl，2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，10×miScript Universal Primer和引物各1 μl，RNase ddH2O 7 μl。反應程序: 95 ℃ 預變性 15 min，94℃ 變性 15 s，55 ℃ 退火30 s，70 ℃延伸30 s, 共40個循環(huán)。每個樣品重復3次，所有反應在7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems，美國)中進行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

RT-qPCR中miRNA相對表達量用 2-ΔΔCT法計算，結果以平均值±標準誤(mean±SE) 表示。

2 結果與分析

2.1 miRNA簇基因在山羊染色體的位置分布

由圖1可知，miRNA簇基因分布于山羊21號染色體，miR-665位置較前，而其他miRNA在染色體的位置相對集中，依次為miR-433、miR-127-5p、miR-432-3p/5p, 最后是miR-136-3p/5p。miR-433與miR-127-5p所處的位置有部分重疊基因位點。通過BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih.gov/) 比較分析miRNA簇基因成熟序列，發(fā)現(xiàn)其在哺乳動物中有較高的保守性。

Chromosome 21-NC_030828.1圖1 miRNA簇基因在山羊染色體的位置Fig.1 miRNA cluster genes in the position of goat chromosome

圖2 miRNA簇基因在波爾山羊體組織的相對表達量Fig.2 Relative expression of miRNA cluster genes in Boer goats tissues

2.2 miRNA簇基因在山羊體組織的表達分析

采用qRT-PCR方法檢測波爾山羊的心、肝、脾、肺、腎和背最長肌組織中miRNA簇基因(miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)的表達量。由圖2 可知，miRNA簇基因(miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)在山羊不同組織中均廣泛表達。miR-127-5p，miR-136-3p， miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433在肌肉中高表達，miR-136-5p和miR-665在肌肉表達量低。

2.3 miRNA簇基因在C2C12細胞不同生肌時間點的動態(tài)表達分析

培養(yǎng)C2C12成肌細胞，分別收集增殖和分化不同階段的細胞樣品，采用qRT-PCR分別檢測在不同生肌時間點細胞中miRNA簇基因(miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)的表達模式。由圖3可知，miR-136-3p表達量隨肌細胞增殖和分化逐漸增加，在培養(yǎng)的第8天中表達最高。miR-127-5p，miR-432-3p，miR-432-5p，miR-433和miR-136-5p表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，miR-127-5p和miR-433在增殖與分化的第6天的表達最高；miR-432-3p在增殖的第2天與分化的第6天表達最高；miR-432-5p在增殖的第4天與分化的第8天表達最高；miR-136-5p在增殖與分化的第2天表達最高。miR-665隨C2C12細胞增殖和分化表達逐漸降低。

3 討 論

通常miRNA與其宿主基因轉錄表達的同時會受到多種因子的調控，miRNA卻往往表現(xiàn)出一定的組織和時空的特異性。miR-1/miR-206 /miR-133僅在肌肉組織中特異表達，而miR-127-3p在動物的多個組織廣泛表達，且在肌肉、皮膚和脾臟中表達較高[6-7]。本研究采用qRT-PCR法對波爾山羊組織中miRNA簇基因的表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)miRNA簇基因(miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)在山羊不同組織中均廣泛表達。miR-127-5p，miR-136-3p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433在肌肉中高表達，miR-136-5p和miR-665在肌肉表達量低。揭示了miRNAs的組織表達特征，確定了miRNA簇基因與山羊肌肉表型的關系。骨骼肌的生長發(fā)育主要表現(xiàn)為肌細胞數(shù)量的增加和體積的增大，這兩方面的順利進行依賴于成肌細胞的增殖和分化[8]。miRNAs在轉錄后水平調控基因表達，在成肌細胞增殖和分化過程中發(fā)揮著重要的作用[9]。筆者近期研究發(fā)現(xiàn) miR-127-3p 表達量隨 C2C12 肌細胞分化逐漸增高，暗示 miR-127-3p 參與骨骼肌細胞分化的調控[6]。體外培養(yǎng)C2C12成肌細胞，采用qRT-PCR法分別檢測在C2C12增殖和分化不同生肌時間點細胞中miRNA簇基因的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)miR-136-3p表達量隨肌細胞增殖和分化逐漸增加。miR-127-5p，miR-432-3p，miR-432-5p，miR-433和miR-136-5p表達量呈現(xiàn)先升高后降低，miR-665在C2C12增殖和分化的過程中表達逐漸降低。該研究首次確定miRNA簇基因在山羊體組織的表達水平，并分析C2C12細胞增殖和分化階段的動態(tài)表達模式。

圖3 miRNA簇基因在C2C12細胞增殖和分化的不同階段的相對表達量Fig.3 Relative expression of miRNA cluster genes during C2C12 myoblast proliferation and differentiation

本研究發(fā)現(xiàn)miR-127-5p在山羊組織中廣泛表達，其在增殖的C2C12細胞的表達量高于分化時期，這與筆者等[6]的研究確定miR-127-3p在山羊體組織廣泛表達，其在增殖的肌細胞的表達量高于分化時期的結果是一致。但文獻報道m(xù)iR-127在桐城豬組織的表達高于長白豬，而且miR-127主要在胚胎發(fā)育的中后期保持較高的表達水平，在發(fā)育的早期和出生后表達相對低[7]。這顯然不同于miR-127在豬上的研究報道。分析原因可能是miR-127 基因在經(jīng)pre-miR-127剪輯后生成兩種形式的成熟的miRNA：miR-127-3p 和miR-127-5p，而該研究僅是檢測miR-127-5p的表達水平。miR-433在肌肉組織和C2C12細胞高表達，其與miR-127來自于同一個重疊基因位點，暗示miR-433可能也在成肌增殖與分化過程中發(fā)揮著重要的作用。但目前研究多集中報道m(xù)iR-433抑制乳腺癌增長[10]，食管癌的增殖與侵襲[11]以及人骨肉瘤細胞凋亡[12]等醫(yī)學方面。miR-432基因在經(jīng)pre-miR-432剪輯后生成兩種形式的成熟的miRNA：miR-432-3p 和miR-432-5p。miR-432-3p在肌肉組織高表達，在增殖的C2C12細胞的表達量高于分化時期，暗示miR-432-3p可能參與骨骼肌肌細胞的生成，與肌肉生長發(fā)育密切相關。這與Ma等[13]發(fā)現(xiàn)miR-432在小鼠的組織與細胞的表達是一致的。但是Ma主要分析了細胞前期中的miR-432的表達，該研究檢測miR-432-3p增殖與分化過程中不同時間點的表達。miR-432-5p在肌肉組織和C2C12細胞高表達，需要進一步的深入研究其在成肌細胞生成過程中的調控功能。miR-136-3p在波爾山羊肌肉組織中高表達，其表達量隨著肌細胞增殖和分化逐漸增加。Lu等[14]高通量測序(RNA-Seq)法分析發(fā)現(xiàn)在豬骨骼肌miR-136表達量高。之前利用高通量測序(RNA-Seq)法對胚胎期和出生的簡洲大耳羊的背最長肌miRNA進行轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)miR-136-5p是骨骼肌高表達miRNA[15]。該研究主要分析成年山羊miR-136-5p的表達水平，可能是由于miR-136-5p在山羊的早期發(fā)育高表達，而成年后表達量減少。進一步揭示了miR-136對哺乳動物骨骼肌的生長發(fā)育起重要作用。研究報道m(xù)iR-665抑制卵巢癌細胞的增長和遷移[16]，同時MiR-665還抑制髓核細胞的增殖和基質降解[17]。miR-665在C2C12細胞增殖和分化的過程中表達逐漸降低。暗示可能其在C212細胞中是具有相同的抑制作用。

通過體內和體外研究分析miRNA簇基因(miR -665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)表達模式，確定在個體與細胞水平miRNAs的表達水平，系統(tǒng)闡述了miRNA簇基因表現(xiàn)出一定的組織和時空的特異性，揭示其對肌肉生長發(fā)育調控的分子機理，不但對將來畜禽基因工程育種，也對人類肌肉疾病的發(fā)病機理的研究與治療提供參考。

4 結 論

體內組織檢測發(fā)現(xiàn)，miRNA簇基因(miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)在山羊不同組織中均廣泛表達。miR-127-5p, miR-136-3p， miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433在肌肉中高表達，miR-136-5p和miR-665在肌肉表達量低。體外細胞檢測發(fā)現(xiàn)，miR-136-3p表達量隨肌細胞增殖和分化逐漸升高；miR-127-5p，miR-432-3p，miR-432-5p，miR-433和miR-136-5p表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；miR-665在隨C2C12細胞增殖和分化表達逐漸降低。綜上，推測miRNA簇基因可能參與骨骼肌細胞增殖與分化的過程。下一步將通過構建過表達、干擾載體，轉染衛(wèi)星細胞或成肌細胞，系統(tǒng)闡述miRNA簇基因對骨骼肌生長發(fā)育的調控功能。