李玉青，王清連，韋春艷，董 濤,陳全家，周瑞陽

(1.新疆農業(yè)大學農學院，新疆 烏魯木齊 830000;2.河南科技學院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.廣西大學農學院，廣西 南寧 530004)

【研究意義】陸地棉是異源四倍體，世界上最重要的經濟作物和油料作物，也是研究多倍體作物的模型[1-2]。隨著經濟和社會的發(fā)展，人們對棉花育種的綜合優(yōu)良品質提出了更高的要求，培育高產是植棉效益的基礎，也是棉花育種的主要目標[3]?！厩叭搜芯窟M展】細胞質雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)為提高作物產量提供了一個優(yōu)越的育種系統(tǒng)，CMS作為質-核互作雄性不育能通過“三系”雜交育種應用于生產，農作物通過雜種優(yōu)勢可以大型商業(yè)化生產F1雜交種子[4-5]。冀FRH3018、中棉所83的選育都是通“三系法”協(xié)同改良篩選出符合育種目標的棉花新品種[6-7]?！颈狙芯壳腥朦c】本試驗以細胞質雄性不育系C2P5A、保持系C2P5B為材料，觀察不育系C2P5A雄性敗育發(fā)生的時期和特點；測定生理生化指標的含量?！緮M解決的關鍵問題】探尋C2P5A細胞質雄性不育系敗育的原因，為棉花雜種優(yōu)勢的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

不育系C2P5A，保持系C2P5B。2018年種植于河南科技學院棉花研究試驗田地，按照常規(guī)方法進行田間管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 花器官觀察以及花粉粒活力測定 在C2P5A不育株和可育株盛花期時，觀察各株的花器官，在掃描儀上觀察并拍照，花粉?；盍y定采用TTC染色，對兩系進行育性鑒定。

1.2.2 細胞形態(tài)學觀察 取花藥的不同發(fā)育時期：小孢子母細胞時期(花蕾縱徑3～4.0 mm)、四分體時期(花蕾縱徑4.1～5.5 mm)、單核時期(花蕾縱徑5.6～6 mm)、雙核時期(花蕾縱徑6.1～8 mm)，成熟的花粉粒時期 (花蕾縱徑8.1～10 mm)， 花蕾縱徑(從蜜腺到花蕾頂端的長度,mm)。用FAA固定液固定，石蠟切片分析花藥的細胞形態(tài)學，按照常規(guī)程序進行石蠟切片，切片厚度8～10 μm，番紅-固綠雙重染色，生物學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 生理生化指標測定 取花蕾、花朵和葉片進行測定?；ɡ俚?個時期：小孢子母細胞時期、四分體時期、雙核時期，所測樣品均以鮮重計。可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)測定參考高俊風主編的植物生理學實驗指導[8]，過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、脯氨酸測定參照王三根植物生理學實驗教程[9]；改良半葉片法測定光合速率[10]，所有指標均設置3個重復，生理生化指標含量利用酶標儀TECHSPARK10M測定。

2 結果與分析

2.1 花器形態(tài)特征及花粉粒TTC活力測定

不育株與保持株花器形態(tài)上有很明顯的差異，主要表現(xiàn)為不育系的整個花朵較保持系的小(圖1-A)。包葉片小，花瓣小(圖1-B)。不育系花柱裸露(圖1-C)。不育系花絲明顯比保持系短，沒有花粉，在生長發(fā)育過程中可能出現(xiàn)褐化死亡(圖1-D)?；ǚ哿＝涍^2 % TTC染色，不育系的花粉粒干癟，形態(tài)大小不均勻，多數(shù)不著色或著色淺，活力明顯弱于保持系；保持系花粉粒飽滿，大小均勻，染色著色深(圖1-E)。

圖1 細胞質雄性不育系和保持系花器形態(tài)結構及花粉?；盍ig.1 The morphological structure and pollen grain vigor of CMS line and its maintainer

A～E為保持系花藥，F(xiàn)～J為不育系花藥。A、F為小孢子母細胞時期×400；B、G為四分體時期×400；C、H為小孢子單核時期×200；D、I為雙核時期×200；E、J為成熟的花粉粒時期×200。MMC為小孢子母細胞；T為絨氈層； ML為中層；EN為藥室內壁；E為表皮層；Tds為四分體；DMMC為降解的小孢子母細胞；Ms為小孢子；CDMMC為完全降解的小孢子母細胞；DT為降解的絨氈層；ET為完整的絨氈層； CT為致密的絨氈層；AAs為敗育的花粉囊；AS為敗育的花藥；Pg為花粉粒；MPg為成熟的花粉粒圖2 細胞質雄性不育系及其保持系不同時期花藥觀察Fig.2 Observed anthers from CMS line and its maintainer at different developmental stages

2.2 花藥不同發(fā)育時期的顯微結構

2.2.1 小孢子母細胞時期 保持系花藥壁從外到內依次是表皮、藥室內壁、中層、絨氈層4層組成，排列規(guī)則，能清晰觀察到中層細胞核，絨氈層細胞核大染色深；4層細胞圍繞在小孢子母細胞周圍(圖2-A)。不育系花藥壁也有4層組成，但是它們的形狀差別不大，特別是絨氈層細胞，體積及著色與其它藥壁細胞相差不明顯(圖2-F)。

2.2.2 四分體時期 小孢子母細胞減數(shù)分裂形成四分體，保持系四分體時期的四層細胞有了顯著差異，中層的細胞變得窄小，絨氈層細胞再進行發(fā)育，體積變大，細胞核變大、染色加深，并緊密圍繞在小孢子四分體周圍(圖2-B)。不育系絨氈層沒有發(fā)育還是整體在一起，并且與其它層緊密粘在一起，不育系小孢子母細胞開始解體(圖2-G)。

2.2.3 小孢子單核時期 保持系絨氈層分泌胼胝質酶，降解圍繞四分體周圍的胼胝質，釋放出單核小孢子，此時，絨氈層也開始解離提供營養(yǎng)(圖2-C)。不育系小孢子母細胞完全解體與絨氈層連在一起，并形成致密的絨氈層(圖2-H)。

2.2.4 雙核及花粉粒成熟時期 保持系絨氈層降解(圖2-D)，被釋放的單核小孢子作為營養(yǎng)吸收，單核小孢子發(fā)育成雙核的花粉粒，并且成熟的花粉粒表面有刺突，絨氈層完全降解(圖2-E)。不育系絨氈層薄壁細胞擴增，填充花粉囊，最終花粉囊內沒有花粉粒的產生(圖2-I)。

2.3 生理生化指標測定結果比較與分析

2.3.1 雄性不育系與保持系可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的比較 可溶性糖為花藥發(fā)育及各物質合成提供能量和原料。從隨著花藥的發(fā)育，不育系和保持系花藥中的可溶性糖含量都逐漸遞增(3-A)，且在花朵中都達到最高值，另外在花藥發(fā)育的各時期中，保持系花藥中的可溶性糖含量都高于不育系花藥，在四分體時期、雙核時期達到顯著差異，花朵中二者的可溶性糖含量達到極顯著差異。

可溶性蛋白質含多種氨基酸，為細胞發(fā)育提供保護。從圖3-B中看出，不育系可溶性蛋白質的含量在花藥發(fā)育各時期、花朵及葉片中都低于保持系，在花藥的四分體時期、雙核時期都達到極顯著差異，花朵中達到顯著差異。

脯氨酸(Pro)參與植物體內應激反應，是作物育種的一個重要生理指標，在逆境脅迫條件下，脯氨酸可以大量積累來對抗逆境脅迫如干旱、鹽漬、寒冷等。脯氨酸的含量在保持系花藥發(fā)育時期、花期一直遞增(圖3-C)，在雙核時期、花朵中二者含量的差異達到極顯著差異，葉片中的含量二者達到顯著差異。

2.3.2 雄性不育系與保持系CAT活性、POD活性、MDA含量及光合速率的比較 過氧化氫酶(CAT)可以清除生物體內的過氧化氫(H2O2)，避免遭受H2O2的毒害。從圖4-A看出，隨著花藥的發(fā)育， CAT活性在不育系、保持系中均呈現(xiàn)下降的趨勢，且在花朵中達到最低值；在小孢子母細胞時期，CAT活性都達到最高值，保持系高于不育系，差異達到極顯著水平；在四分體時期、雙核時期CAT活性不育系高于保持系分別達到極顯著差異、顯著差異；葉片中CAT活性不育系高于保持系差異達到極顯著水平。

I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分別表示葉片、小孢子母細胞時期、四分體時期、雙核時期、花朵。下圖相同注釋。各圖中小寫字母代表0.05下差異，達到顯著水平；大寫字母代表0.01下差異，達到極顯著水平；沒有字母標記代表差異小，不顯著圖3 細胞質雄性不育系及保持系葉片、花藥發(fā)育、花中可溶性糖(A)、可溶性蛋白含量(B) 及脯氨酸含量(C)Fig.3 CMS lines and maintainer lines leaves, anther development stage and flowers of soluble sugar content(A)，soluble protein content(B) and proline content (C)

作為膜脂過氧化的產物丙二醛(MDA)，它能加劇細胞膜的損傷，所以了解膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性可以測定MDA。從圖4-B可以看出，花藥發(fā)育過程中，在不育系、保持系中MDA含量都逐步降低，但在同時期不育系的含量始終高于保持系；葉片中MDA含量不育系低于保持系。

過氧化物酶(POD)具有消除過氧化氫和酚類、胺類、醛類、苯類毒性的雙重作用。圖4-C顯示，花藥發(fā)育時期，不育系的POD活性總體呈現(xiàn)下降趨勢；在小孢子母細胞時期及葉片中不育系的POD活性高于保持系，差異達到極顯著水平，而在花朵中不育系的POD活性低于保持系，達到顯著差異。

光合速率是植物光合效率的重要指標，光合速率越高，碳水化合物產生的越多。圖4-D顯示，在同等條件下，不育系的光合速率極顯著低于保持系的光合速率。

3 討 論

3.1 雄性不育系敗育時期

研究[11-13]表明棉花不育系的敗育時期主要發(fā)生在小孢子母細胞減數(shù)分裂時期，在減數(shù)分裂過程中解體。劉記等[14]研究新型光敏不育系，花藥的敗育主要發(fā)生小孢子單核后期；吳元龍[15]在研究不育系1355A觀察到敗育在小孢子時期，小孢子萎縮變形，花粉外壁沒有棘突。

本試驗石蠟切片觀察到不育系的絨氈層細胞在小孢子母細胞時期較之保持系著色淺，在四分體時期較之保持系沒有進行發(fā)育，導致不育系小孢子母細胞在進行減數(shù)分裂時沒有得到絨氈層營養(yǎng)的供給，不能進行正常減數(shù)分裂，開始解體。

3.2 雄性不育與花藥部分物質代謝的關系

小孢子發(fā)育過程中需要大量的蛋白質、氨基酸和糖類等營養(yǎng)物質作為生長發(fā)育的基礎，周國昌等[16]花藥發(fā)育過程中提出“物質虧損”，認為營養(yǎng)供應不足，導致小孢子異常發(fā)育。

本實驗研究表明隨著花藥的發(fā)育，可溶性糖含量在不育系中都低于同時期的保持系，光合速率顯著低于保持系，二者相吻合，即保持系產生的碳水化合物糖類高于不育系；花藥發(fā)育時期，可溶性蛋白質的含量在不育系中都低于同時期的保持系，特別在四分體時期、雙核時期含量極顯著低于保持系，表明營養(yǎng)供應不足，是導致雄性不育的重要原因之一；脯氨酸含量在不育系中幾乎都低于同時期的保持系，特別在雙核時期、花朵中都達到極顯著差異，這也是導致不育系花藥發(fā)育瘦弱，褐化死亡，抗逆性差的原因，這些生理代謝異常都是造成小孢子母細胞敗育的原因。

各圖中小寫字母代表0.05下差異，顯著水平；大寫字母代表0.01下差異，極顯著水平；沒有字母標記代表差異小，不顯著圖4 細胞質雄性不育系及保持系葉片、花藥發(fā)育、花期CAT活性(A)、MDA含量(B)、POD活性(C)及光合速率(D)Fig.4 CMS lines and maintainer lines leaves,anther developments tage and flowers of CAT activity(A),MDA content(B),POD activity(C) and Photosynthetic rate (D)

3.3 雄性不育系與花藥抗氧化系統(tǒng)中關鍵酶活性的關系

劉莉等[17]在水稻上的研究表明，在敗育前期， CAT酶活性降低，不能及時清除體內產生的有害自由基，造成自由基累積，致使膜脂過氧化作用加劇，這與本試驗結果一致，在敗育前， CAT活性不育系顯著低于保持系，對細胞造成毒害作用。

本試驗POD活性不育系在敗育前比保持系高，這與周仲華等[18]對棉花不育系的研究相一致，植物體內POD活性升高會促使生長素氧化分解，花藥所需要的營養(yǎng)物質不能滿足，另外造成花序中乙烯大量積累，造成細胞衰老，引起花藥敗育。

MDA在生物有機內活性氧毒害的指標，周仲華等研究表明植物體內含有較高的MDA是造成膜脂過氧化增強，造成敗育的重要原因[18]。本試驗不育系花藥中膜脂過氧化產物的MDA含量高于保持系，活性氧毒害的程度較高，使細胞膜系統(tǒng)受到破壞或損傷，造成細胞內生理代謝紊亂，引起棉花雄性敗育。

4 結 論

棉花細胞質不育系C2P5A與對照保持系比較，在花藥石蠟切片中觀察到不育系敗育可能有以下兩個原因，一絨氈層發(fā)育異常，不能及時提供營養(yǎng)給小孢子母細胞，造成敗育；二絨氈層內部的薄壁細胞徑向伸長，填充整個花藥，花粉粒不能形成，造成敗育。

測定生理生化指標，找出不育系形成敗育的原因，其一可溶性糖、可溶性蛋白在不育系中的含量比同時期保持系低，造成不育系營養(yǎng)供應不足，使小孢子母細胞分化受阻，此分析與石蠟切片不育系絨氈層沒有發(fā)育，營養(yǎng)供應不足造成敗育相一致；其二MDA在不育系中的含量比同時期保持系高，活性氧對不育系的細胞膜造成傷害；在敗育前，CAT活性過低，不能及時清除體內產生的有害自由基，致使活性氧毒害作用加劇，以上都是造成不育系敗育的原因。