朱燕蕾，郭鳳根

(1. 云南農業(yè)大學 園林園藝學院，云南 昆明 650201；2. 云南農業(yè)大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

黃楊葉栒子（Cotoneaster buxifoliusLindl.）是薔薇科栒子屬(Cotoneaster)的常綠至半常綠灌木，產四川、貴州、云南等省，生于海拔1 000～3 300 m的多石礫坡地、灌林叢中[1]。黃楊葉栒子在4—6月開花，花3～5朵，在8月至次年2月紅色的果實掛滿植株，是優(yōu)良的觀花、觀果植物，根系發(fā)達，是優(yōu)良的護坡植物，具有很高的開發(fā)價值[2]。野外調查發(fā)現(xiàn)，不同產地的黃楊葉栒子間在表型性狀上存在較大差異，但根據(jù)前期查閱的文獻，有關滇產黃楊葉栒子的遺傳多樣性研究尚未見報道[3-5]。

用表型性狀來檢測遺傳變異是直接、簡便、易行的方法，但表型性狀受環(huán)境因素的影響，在某些情況下并不能反映遺傳變異的真實狀況。分子生物學技術的快速發(fā)展為遺傳多樣性檢測提供了更直接和精確的方法，其中，ISSR（inter-simple sequence repeat）分子標記技術由于具有引物通用性強、利用率高、操作簡便和重復性好等優(yōu)點，在植物的遺傳多樣性、系統(tǒng)進化、DNA指紋圖譜及核心種質構建等方面已得到廣泛的應用[6-10]。本文以云南不同產地的黃楊葉栒子為材料，從表型性狀和ISSR分子標記2個角度分析其遺傳多樣性，為其種質資源的合理利用和保護奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

對云南省內7個州市15個縣區(qū)市的51個野生黃楊葉栒子居群進行了調查和表型性狀的觀測，采集各居群葉片并用硅膠干燥于自封口袋中，編號后保存于-80 ℃冰箱，用于ISSR分子標記試驗。各居群的產地、代碼、緯度、經度和海拔等信息見表1。

表 1 51份黃楊葉栒子材料的來源及重要地理特征Table 1 Sources and important geographic characters of 51 C. buxifolius samples

續(xù)表 1

1.2 表型性狀的觀測

觀測了51個野生黃楊葉栒子居群的枝條顏色和夾角及毛被情況、葉片的形態(tài)及毛被情況、花朵的數(shù)量、花瓣的形狀和顏色，將采集的果實帶回實驗室后觀測果實的顏色、形狀及大小、萼筒毛被情況、萼裂片形狀及毛被情況、每果小核數(shù)，共計觀測了33個表型性狀。

1.3 ISSR分析

采用改良CTAB法提取黃楊葉栒子各樣品的葉片總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，用紫外分光光度法測定DNA濃度，達到ISSR分子標記要求的DNA保存于-20 ℃冰箱備用[11-13]。對DNA質量檢測，有27個居群達到后續(xù)分析的要求。從100條ISSR引物中篩選出24條適于黃楊葉栒子擴增的引物，用優(yōu)化后的反應體系（25 μL反應體系中含 2.5 mmol·L-1Mg2+、2U Taq DNA聚合酶、0.15 mmol·L-1dNTPs、0.48 mol·L-1引物和100 ng模板DNA）對黃楊葉栒子的DNA模板進行擴增，程序如下：95 ℃預變性5 min，1個循環(huán)；94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，進行38個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并拍攝照片，根據(jù)有帶為1、無帶為0的原則對重復性好且清晰易辨的條帶進行統(tǒng)計，獲得27個居群的24條引物的“0，1”ISSR 數(shù)據(jù)矩陣。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

對表型性狀中的質量性狀進行賦值后參與聚類運算；對數(shù)量性狀則直接用SPSS 16.0軟件進行平均值、標準差、標準誤的計算和方差分析，進而計算出各性狀的變異系數(shù)和相對極差。依據(jù)33個表型性狀的歐氏平方距離系數(shù)，用UPGMA法構建基于表型性狀的樹系圖。

依據(jù)獲得的27個居群的24條引物的ISSR數(shù)據(jù)計算各引物的總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)和多態(tài)性百分率；應用SPSS 16.0軟件，根據(jù)歐氏平方距離系數(shù)，用UPGMA法構建基于ISSR標記的27個黃楊葉栒子居群的樹系圖。采用POPGEN 32軟件計算滇西北群體（DXB）、宣威群體（XW）、嵩明群體（SM）、石林群體（SL）、昆明群體（KM）和會澤群體（HZ）等6個產區(qū)的黃楊葉栒子居群的多態(tài)性位點百分比（PPB）、觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon信息指數(shù)（I）和遺傳多樣性指數(shù)（Ht）。

2 結果與分析

2.1 基于表型性狀的遺傳多樣性分析

2.1.1 表型性狀分析 各黃楊葉栒子居群的枝條顏色全部為棕褐色；所有小枝都被糙伏毛；二級枝條與主枝之間的夾角為80.07°～37.67°，平均為42.4°，平均變異系數(shù)為16.53%；葉片長度為0.6～1.83 cm，葉片寬度為0.37～1.26 cm，二者變異系數(shù)分別為23.19%和28.78%；葉片質地紙質占100%；葉片形狀為卵形；葉基形狀98.04%為近圓形，還有1.96%為寬楔形；葉尖形狀有98.04%為銳尖，有1.96%為鈍尖；葉片正面98.04%有毛，有1.96%為幼時有毛；葉片正面都疏被白色絨毛；葉片背面都疏被灰白色絨毛；100%花序具有1朵以上的花；花朵顏色全部為白色；果實均為紅色鐘狀果；萼筒全部密疏絨毛；果實縱徑為5.48～8.29 mm，果實的橫徑為5.37～7.76 mm，變異系數(shù)分別為18.00%和17.34%；果實萼裂片形狀變異相對較大，變異系數(shù)為69.02%，其中，尖三角形占54.90%，寬三角形間隔縫大占33.33%，寬三角形占9.8%，幾乎不開裂占1.96%；果實萼裂片中94.12%被毛，其中，66.67%是被密絨毛，而33.33%被疏絨毛，其變異系數(shù)達35.17%；26.56%的果實包含1個小核，39.06%的果實包含2個小核，28.91%的果實包含3小核，4.69%的果實包含4小核，只有0.78%的果實含5小核。

圖 1 基于表型性狀51份黃楊葉栒子資源UPGMA聚類圖Fig. 1 UPGMA dendrogram of 51 C. buxifolius resources based on the phenotypic traits

2.1.2 各表型性狀的聚類分析 依據(jù)33個表型性狀的51個野生黃楊葉栒子居群的UPGMA樹系圖見圖1。各居群之間的距離在25閾值內，51個樣本在遺傳距離系數(shù)25處可以劃分為2個類群，其中，類群II包括了3個居群，二級枝條與主枝之間的夾角為 78°～80°，葉片長度為 0.9～1.0 cm，葉片寬度為0.5～ 0.55 cm，屬于所有居群中夾角最大的一組；類群I中，在遺傳距離系數(shù)為10處可以分為I-1和I-2兩個分支，其中，I-2分支中包括了21個居群，二級枝條與主枝之間的夾角多數(shù)為62°～68°，居群分布海拔在 1 900～2 500 m；I-1 類群中，在遺傳距離系數(shù)8處分為I-1-1和I-1-2兩個分支，分別包括了26個和1個居群。I-1-1分支中，一個小分支夾角基本為53°～57°，另一小分支則保持在42°～49°；I-1-2分支中僅有1個來自昆明居群的栒子，其夾角最?。?7°）。從圖1可看出：51個黃楊葉栒子居群間的親緣關系，多數(shù)地理位置或者海拔相近的居群能夠聚在同一分支，但有些同一產地的不同居群卻分布在不同的分支中。

2.2 基于ISSR分子標記的遺傳多樣性分析

2.2.1 黃楊葉栒子 ISSR多樣性分析 24條ISSR引物對27個黃楊葉栒子居群共擴增出228條帶，其中，多態(tài)性條帶有153條，每條引物擴增得到的總條帶數(shù)為5～14，平均9.50條；多態(tài)性條帶數(shù)為3～13，平均6.38條；多態(tài)百分率為58.33%～100.00%，多態(tài)百分率達81.56%（表2）。

將采自滇西北、宣威、嵩明、石林、昆明、會澤地區(qū)的27個居群按產區(qū)進行歸類后用PopGene 32 軟件分析，得表3。6個產區(qū)平均擴增出151.67多態(tài)性位點，多態(tài)性位點比率達到66.52%，其中，嵩明產區(qū)多態(tài)性位點最多，達170，多態(tài)性位點比率達74.56%；會澤產區(qū)的多態(tài)性位點最少，只有122，比率53.51%。群體間平均Nei`s遺傳多樣性指數(shù)為0.413 2，Shannon多樣性指數(shù)為0.595 9，群體內多態(tài)性位點比率為53.51～74.56%。Nei`s遺傳多樣性指數(shù)（H）為0.156 2～0.432 5，平均為0.352 0；Shannon多樣性指數(shù)（I）為 0.216 6～0.621 2，平均 0.505 9。6個產地中，HZ群體（H=0.156 2，I=0.216 6）的遺傳多樣性水平最低，KM群體（H=0.432 5，I=0.621 2）的遺傳多樣性水平最高。Nei`s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)和多態(tài)性位點比率3個指標所表現(xiàn)的多樣性趨勢基本一致，6個群體遺傳多樣性由高到低依次為:KM 群體 ＞XW 群體 ＞ SL 群體 ＞SM 群體＞DXB群體＞HZ群體。經計算可知，遺傳多樣性指數(shù)（Ht）為0.413 2±0.011 0。XW群體與KM群體的遺傳距離最大（0.980 8），XW群體與DXB群體遺傳距離相對較近（0.330 2）；XW群體與KM群體遺傳一致度最低（0.375 0），XW群體與DXB群體遺傳一致度最高（0.718 8）。其余遺傳一致度基本在0.48左右，4個群體間的遺傳一致度變幅為 0.375 0～0.718 8。

表 2 24條引物的擴增結果Table 2 Amplification results of 24 primers

表 3 栒子群體的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of populations of C. buxifolius

2.2.2 基于ISSR分子標記的黃楊葉栒子居群間親緣關系 用SPSS 16.0軟件計算27個黃楊葉栒子居群間的歐氏平方距離系數(shù)，采用 UPGMA 聚類方法，得到27個黃楊葉栒子居群的聚類樹系圖（圖2）。從圖2可以看出：以距離系數(shù)23為界，可以將27個居群劃分為3大分支：分支I包含13個居群，又可進一步細分為昆明、嵩明組（I－1），5個居群基本分布在海拔2 050 m左右，石林等組（I－2）6個居群分布在海拔1 950～2 100 m；分支II包含3個居群，包括了全部來自滇西北的居群；分支III包含11個居群，可進一步細分為昆明、宣威等組（III－1），包括了9個居群，昆明與會澤（III－2、III-3）2個分支，各自包括1個居群，其均分布在海拔2 400 m的地區(qū)。

3 討論

3.1 黃楊葉栒子的遺傳多樣性豐富

表型性狀是種質資源遺傳多樣性的一種表現(xiàn)方式，與分子標記有著同等重要的作用，同時也是育種和種質保護研究的基礎工作[14-15]。本研究選取33個表型性狀，對51個野生黃楊葉栒子居群的遺傳多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)有22個性狀均表現(xiàn)出不同程度的變異，且變異主要存在于居群之間，變異系數(shù)較大的性狀有萼裂片形狀（69.02%）、萼裂片毛被情況（35.71%）、葉片寬度（28.78%）、葉片長度（23.19%）等，說明黃楊葉栒子居群間在果實萼裂片和葉片形態(tài)上存在較大的差異，大于野生玫瑰（18.48%）[16]、假儉草（25.59%）[17]、垂珠花（22.64%）[18]，但這些差異均沒有準噶爾山楂（86.10%）[19]的大。

圖 2 基于ISSR標記分析27份黃楊葉栒子資源UPGMA聚類圖Fig. 2 UPGMA dendrogram of 27 C. buxifolius resources based on the ISSR marker

ISSR分子標記可以產生豐富的多態(tài)位點，從而揭示種間、種內遺傳變異情況[4]。本文利用ISSR分子標記對27個野生黃楊葉栒子居群進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)多態(tài)百分率達81.56%，說明云南的黃楊葉栒子資源存在較豐富的遺傳多樣性，其豐富程度與棗莊石榴（82.86%）[7]相近，但不如大別山區(qū)的白檀（92.62%）[20]和杜鵑花（98.94%）[21]高。

3.2 黃楊葉栒子居群間的親緣關系

本文用33個表型性狀構建了51個黃楊葉栒子居群的樹系圖（圖1），用24個ISSR引物的228條條帶構建了27個黃楊葉栒子居群的樹系圖（圖2）。2張圖對比分析可知：在ISSR聚類圖中I-1分支中的5個居群，有 3個居群（SM1、SM2、KM8）在表型性狀聚類圖中都屬于I-1-1這個分支，表型性狀和ISSR分子標記所得結果都表明這3個居群的親緣關系近；而其中的KM3居群在表型性狀圖中屬于I-2分支，2種聚類方法結果不一致。分析此現(xiàn)象出現(xiàn)的原因：一是黃楊葉栒子居群間的親緣關系與地理位置密切相關，分布在同一地區(qū)的各個居群多數(shù)能聚在一起，如昆明群體、滇西北群體、石林群體和會澤群體的部分材料可分別聚為一類，說明分布位置的隔離促進了黃楊葉栒子居群間的遺傳分化[22-23]；二是個別居群未能與同一產區(qū)的其他居群聚在一起，而聚進了其他產區(qū)的居群之中，其原因可能是同一產區(qū)內各居群的小生境不完全相同，在不同產區(qū)內也有相似的小生境，生境的不同導致不同居群間發(fā)生遺傳分化和趨同進化。在材料采集時發(fā)現(xiàn)，雖然有些居群采集自同一產地，但它們的生境(土壤、水分、坡度、坡向、光照、海拔高度、伴生植物等)各不相同；但有些居群雖然采自不同的產地，但卻擁有極為相似的生境，導致黃楊葉栒子呈現(xiàn)地域性趨同進化[24]。

3.3 地理隔離促進栒子居群間的遺傳分化

正如沙棘，由于其分布區(qū)廣泛,分布區(qū)內氣候、土壤和海拔等生態(tài)因子的差異，地理隔離促進其高度種群遺傳分化，形成11亞種[1,25]。地理隔離是物種間基因交流的天然屏障，也是影響居群間遺傳分化的重要因素[26]。在聚類分析中，昆明群體（I-1分支中 3個居群和III-1亞分支中3個居群）、石林群體（I-2亞分支中6個居群）、滇西北群體（II分支中3個居群）可分別聚為一類。昆明群體和石林群體的栒子分布于滇中盆地區(qū)域，但2個地區(qū)相距70 km，受蟲媒和鳥媒飛行距離的影響，依靠其在居群間傳播花粉的能力必定受到地理距離的限制[27]，空間隔離是居群間遺傳分化的因素；而滇西北群體則分布在三江并流區(qū)域，群體間在地理分布上有橫斷山脈阻隔，使得物種區(qū)域分布的山脈阻隔特點突出，對黃楊葉栒子不同的居群具有天然的隔離作用，山脈阻隔嚴重影響了居群間花粉及種子散布，也使居群之間的基因交流受到了一定程度的阻礙[28]，是引起居群間遺傳分化的重要因素。

表型性狀是植物的外部特征，標記數(shù)量少，且受到生境、生長狀況和時期等方面因素的影響，利用受限。表型性狀與ISSR分子標記所提供的DNA片段信息相結合，可以揭示黃楊葉栒子遺傳的本質特征。同時通過遺傳聚類了解栒子遺傳變異在地理上的分布格局，對于制定科學的保護策略起著極為重要的作用。上述黃楊葉栒子遺傳多樣性分析將為今后黃楊葉栒子種質資源分類、起源、保存和利用奠定基礎。

4 結論

本研究表明：滇產黃楊葉栒子表型性狀和分子遺傳多樣性豐富。根據(jù)分子標記聚類結果可以將27個居群分為3個分支。黃楊葉栒子居群間的親緣關系及分布與地理位置、海拔位置有密切關系。