王丹丹

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150227）

減蛋綜合征76（EDS76）是由減蛋綜合征病毒（EDS76V）引起的雞的重要病毒病之一，可引起產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋量降低和產(chǎn)蛋品質(zhì)下降。該病已在世界范圍內(nèi)的許多國(guó)家流行，成為引起產(chǎn)蛋損失的主要疫病之一[1-2]。EDS76V可使雞產(chǎn)蛋率下降10%～30%，甚至高達(dá)41%，蛋的破損率達(dá)38%～40%，無(wú)殼蛋、軟殼蛋達(dá)15%，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，1976年Yan首次分離到雞減蛋綜合征病毒（EDS76V）[3-4]。我國(guó)于20世紀(jì)80年代末在肉用種雞群中發(fā)現(xiàn)減蛋綜合征以來(lái)，相繼分離到許多株EDS76V病毒[5-7]。2005年黑龍江省綏化市1個(gè)體養(yǎng)雞場(chǎng)的190日齡商品蛋雞突然出現(xiàn)產(chǎn)蛋下降，產(chǎn)蛋率由95.4%下降到72.5%，蛋殼顏色變淺，并出現(xiàn)大量的弱殼蛋、無(wú)殼蛋、沙殼蛋和畸形蛋；除了表現(xiàn)產(chǎn)蛋下降，并無(wú)其他明顯的臨床癥狀，初步懷疑為減蛋綜合征。采集發(fā)病雞的輸卵管，用鴨胚進(jìn)行病毒分離，分離到一株具有血凝性病毒，經(jīng)一系列鑒定，確定為EDS76V，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鴨胚：9～10日齡鴨胚，從無(wú)減蛋綜合征感染的鴨場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)鴨蛋，自行孵化。病毒陽(yáng)性血清：新城疫病毒（NDV）和減蛋綜合征病毒（EDS76V）陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 病毒分離

1.2.1 病料采集和處理

取產(chǎn)軟殼蛋和無(wú)殼蛋、初步懷疑感染減蛋綜合征病毒的雞，剖殺，取輸卵管的狹部，用研缽研磨，加入PBS液制成懸液，反復(fù)凍融3次，3 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，按每毫升液體加入青霉素2 000 U、鏈霉素2 000 μg，4℃放置4 h，取上清，作為鴨胚接種材料。

1.2.2 樣品接種

將處理好的病料，經(jīng)尿囊腔分別接種10日齡鴨胚，0.2 mL·胚-1，每個(gè)樣品接種5枚，置37℃孵育觀(guān)察。

1.2.3 胚液收獲及傳代

孵化至96 h取出，置4℃冰箱過(guò)夜，收取尿囊液。將收獲的鴨胚尿囊液接種10日齡鴨胚，繼續(xù)盲傳2代，對(duì)于有凝集效價(jià)的樣品，繼續(xù)傳代到10代。

1.2.4 血凝實(shí)驗(yàn)（HA）

對(duì)每次收獲的鴨胚尿囊液進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)，按《獸藥典》血凝實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

1.3 病毒分離株（E10代）免疫學(xué)試驗(yàn)鑒定

1.3.1 瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（AGP）

將含病毒鴨胚尿囊液，3 000 r·min-1離心30 min，取上清，并用0.2%甲醛滅活，以4 000 r·min-1離心2 h，棄上清，按原液量的1/10向沉淀中加入滅菌PBS，溶解沉淀，3 000 r·min-1離心30 min，取上清，作為AGP抗原。將制備的AGP抗原與購(gòu)買(mǎi)的EDS76V陽(yáng)性血清做AGP實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI）

分別用ND和EDS76病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清與血凝陽(yáng)性的鴨胚尿囊液進(jìn)行HI實(shí)驗(yàn)。

1.4 病毒分離株（E10代）理化特性鑒定

1.4.1 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取2份病毒液，每份0.5 mL，分別進(jìn)行65℃、30 min和56℃、3 h處理，將2份處理過(guò)的病毒液和未經(jīng)處理的對(duì)照病毒液分別接種10日齡的鴨胚，每個(gè)處理接種5枚，培養(yǎng)后收獲病毒液，測(cè)定HA效價(jià)。

1.4.2 對(duì)乙醚和氯仿敏感性實(shí)驗(yàn)

取2份病毒液，每份0.5 mL，向其中1份加入1.0 mL乙醚，振蕩10 min，置4℃過(guò)夜，揮發(fā)除去乙醚；向另一份病毒液加入氯仿0.025 mL，振蕩后于4 ℃作用1 h后，3 000 r·min-1離心10 min，取上層病毒液。將2份處理過(guò)的病毒液和未經(jīng)處理的對(duì)照病毒液分別接種10日齡的鴨胚，每個(gè)處理接種5枚，培養(yǎng)后收獲病毒液，測(cè)定HA效價(jià)。

1.4.3 耐酸實(shí)驗(yàn)

取2份病毒液，每份0.5 mL，用0.1N的HCl將2份病毒液分別調(diào)pH至3和5，4℃與病毒作用2 h，用5%的NaHCO3將pH調(diào)回至7。將2份處理過(guò)的病毒液和未經(jīng)處理的對(duì)照病毒液分別接種10日齡的鴨胚，每個(gè)處理接種5枚，培養(yǎng)后收獲病毒液，測(cè)定HA效價(jià)。

1.5HS25分離株P(guān)CR鑒定

1.5.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank登錄的EDS76V標(biāo)準(zhǔn)株AV-127（登錄號(hào)：NC_001813.1）的基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物擴(kuò)增HS25株P(guān)VⅢ基因的編碼區(qū)，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為0.753 bp。

P1：5'-cgcgccaatgcagcctgtgacc-3'

P2：5'-aacatattgaagagtacgatcag-3'

1.5.2 HS25株P(guān)VⅢ基因的擴(kuò)增及克隆

病毒經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃變性40 s，48℃退火40 s，72℃延伸60 s；運(yùn)行5個(gè)循環(huán)后，繼續(xù)按下列條件運(yùn)行：94℃變性30 s，52℃退火30s，72℃延伸40s；運(yùn)行30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min，4℃運(yùn)行10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定，用核酸純化試劑盒回收獲得目的片斷，并克隆到pMD18-T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-HS25。

1.5.3 HS25株P(guān)VⅢ基因核苷酸序列的測(cè)定

將經(jīng)過(guò)鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒pT-HS25送到大連寶生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列與GenBank上的EDS76標(biāo)準(zhǔn)株AV-127的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較，比較兩者之間的差異。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 病毒的分離

病料接種鴨胚傳代不同代次尿囊液HA效價(jià)見(jiàn)表1。

表1 病料接種鴨胚傳代不同代次尿囊液HA效價(jià)（1∶X）

將來(lái)自發(fā)病雞場(chǎng)的3份輸卵管病料混合處理后，經(jīng)尿囊腔，接種5枚10日齡鴨胚。37℃培養(yǎng)96 h，收獲尿囊液，繼續(xù)盲傳2代，每次接種5枚10日齡鴨胚。盲傳2代后，出現(xiàn)血凝性，HA效價(jià)為1∶64～1∶256。將具有血凝性的病毒液繼續(xù)傳到10代。從第5代開(kāi)始，血凝效價(jià)顯著升高，HA效價(jià)達(dá)到1∶2 048～1∶10 240，到第10代，HA效價(jià)達(dá)到1∶40 960；鴨胚出現(xiàn)規(guī)律性死亡，到接種后96 h，死亡率可達(dá)70%，鴨胚出現(xiàn)明顯病變，鴨胚的頭、四肢、喙有明顯的出血。將分離到的這株EDS76V命名為HS25株。

2.2 病毒分離株（E10代）的鑒定

2.2.1 HS25病毒的HI及AGP實(shí)驗(yàn)

HS25病毒的HI及AGP實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 病毒分離株HS25（E10代）的HI實(shí)驗(yàn)和AGP實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別用ND和EDS76陽(yáng)性血清對(duì)上述分離到的具有血凝性（HA）的HS25分離株做血凝抑制（HI）實(shí)驗(yàn)。結(jié)果為：HS25病毒只能抑制EDS76陽(yáng)性血清，而不能抑制ND亞型血清。按標(biāo)準(zhǔn)方法制備成抗原，與EDS76陽(yáng)性血清做AGP實(shí)驗(yàn)，可產(chǎn)生陽(yáng)性沉淀線(xiàn)。

2.2.2 HS25病毒的理化特性

熱穩(wěn)定試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 病毒分離株HS25的HI試驗(yàn)和AGP試驗(yàn)結(jié)果

病毒HS25株經(jīng)過(guò)65℃、30 min處理后，接種鴨胚，經(jīng)培養(yǎng)，尿囊液不再具有血凝特性；而病毒經(jīng)56℃、3 h處理后，接種鴨胚，經(jīng)培養(yǎng)，尿囊液仍然具有血凝特性。這說(shuō)明病毒經(jīng)65℃、30 min處理可以被滅活，能夠耐過(guò)56℃、3 h處理。

對(duì)乙醚和氯仿敏感性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 病毒分離株HS25對(duì)乙醚和氯仿敏感性試驗(yàn)結(jié)果

病毒HS25株經(jīng)乙醚和氯仿處理，接種鴨胚，與未處理的對(duì)照比，病毒的HA效價(jià)沒(méi)有明顯變化。這說(shuō)明病毒能夠抵抗乙醚和氯仿處理，病毒不含黏膜和脂質(zhì)成分。耐酸試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 病毒分離株HS25耐酸試驗(yàn)結(jié)果

病毒HS25株經(jīng)pH5和pH3處理后接種鴨胚，與未處理的對(duì)照比，病毒的HA效價(jià)沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明病毒HS25株具有耐酸性。

2.2.3 HS25株病毒PVⅢ基因PCR的擴(kuò)增和核苷酸序列的測(cè)定

HS25株病毒PVⅢ基因PCR的擴(kuò)增和核苷酸序列的測(cè)定見(jiàn)圖1～2。

圖1EDSV HS25株P(guān)VⅢ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 EDS76的AV127株和HS25株P(guān)VⅢ基因片段核苷酸同源性

通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增HS25株病毒PVⅢ蛋白核苷酸，與預(yù)期的片段大小相同，并進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。通過(guò)與EDS76V的標(biāo)準(zhǔn)株相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行比較，核苷酸同源性96.7%。從而證明HS25株病毒是一株EDS76病毒。

3 結(jié)論

2005年從黑龍江省綏化市一雞場(chǎng)分離到一株具有血凝性的病毒。經(jīng)過(guò)HI實(shí)驗(yàn)、AGP實(shí)驗(yàn)、理化特性和PCR序列擴(kuò)增及測(cè)序，證明是EDS76V。