劉一鳴，袁方超，王孟皓

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶 400010

當(dāng)肝臟發(fā)生損傷時(shí)，一系列信號(hào)通路被激活從而啟動(dòng)肝臟再生(LR)，通過剩余肝組織的迅速擴(kuò)張來滿足機(jī)體代謝需求。HIGGINS等[1]利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果，大鼠約70%的肝臟被切除后剩余肝臟可在5～7 d內(nèi)基本恢復(fù)至術(shù)前的質(zhì)量、體積及功能，隨后細(xì)胞又重新恢復(fù)靜止。有研究認(rèn)為，整個(gè)LR過程包括3個(gè)階段：?jiǎn)?dòng)、增殖和終止[2]。在啟動(dòng)階段，包括腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細(xì)胞介素(IL)-6在內(nèi)的一系列細(xì)胞因子作用于肝細(xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)生長(zhǎng)因子的敏感性。多種生長(zhǎng)因子的刺激使肝細(xì)胞重新進(jìn)入G1期從而進(jìn)入增殖階段，當(dāng)肝組織功能足以維持機(jī)體正常的代謝需求后，肝細(xì)胞則重新進(jìn)入G0期停止增殖[3]。目前針對(duì)LR研究大多數(shù)集中于再生早期的啟動(dòng)信號(hào)，而再生晚期所涉及的終止信號(hào)尚不完全明確。因此，本研究探討了LR晚期的負(fù)性調(diào)控信號(hào)及其所涉及的關(guān)鍵基因，旨在加深對(duì)LR過程、肝細(xì)胞肝癌(HCC)生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制的闡釋以及潛在治療靶點(diǎn)篩選的認(rèn)識(shí)。近年來，伴隨高通量測(cè)序及計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，綜合利用生命科學(xué)、計(jì)算機(jī)及信息技術(shù)來解析海量而復(fù)雜生物數(shù)據(jù)背后的潛在意義成為可能。本研究通過生物信息學(xué)分析，選取LR終止階段相關(guān)基因芯片，挖掘、篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)基因(DEGs)并進(jìn)行分析以尋找出在該過程中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因及通路。

1 資料與方法

1.1一般資料 利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)為工具，以“l(fā)iver regeneration”為關(guān)鍵詞，選取并下載大鼠肝臟切除(PH)術(shù)后肝組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)集(GSE63742)，該數(shù)據(jù)集共包含PH術(shù)后9個(gè)時(shí)間點(diǎn)共57個(gè)樣本，本研究選取PH術(shù)后7 d共6個(gè)樣本(假手術(shù)組3個(gè)，PH組3個(gè))作為大鼠LR終止階段基因表達(dá)的原始數(shù)據(jù)。

1.2方法

1.2.1基因芯片質(zhì)量驗(yàn)證 在R語(yǔ)言(https://www.r-project.org/)中調(diào)用“affyPLM”軟件包對(duì)原始數(shù)據(jù)回歸計(jì)算進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)證，結(jié)果采用相對(duì)對(duì)數(shù)表達(dá)(RLE)箱線圖、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(NUSE)箱線圖以及RNA降解圖進(jìn)行評(píng)估和展示[4]。

1.2.2芯片數(shù)據(jù)處理及DEGs篩選 利用R語(yǔ)言中“affy”“l(fā)imma”軟件包[5-6]對(duì)芯片原始數(shù)據(jù)做如下處理：(1)背景校正及分位數(shù)均一化；(2)篩選DEGs，條件為log2[倍數(shù)變化(FC)]絕對(duì)值>1.5同時(shí)校正P<0.001；(3)通過芯片平臺(tái)文件將探針I(yè)D轉(zhuǎn)為基因名稱。分析結(jié)果利用R語(yǔ)言“ggplot2”軟件包進(jìn)行可視化。

1.2.3京都基因與基因組百科全書(KEGG)和基因本體(GO)富集分析 用在線工具DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[7]對(duì)所得DEGs進(jìn)行KEGG通路以及GO富集分析[8-9]。GO富集分析包括生物學(xué)過程、細(xì)胞組分以及分子功能共3個(gè)部分。分析結(jié)果利用R語(yǔ)言“ggplot2”軟件包進(jìn)行可視化。

1.2.4蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選 將上述步驟所得到DEGs輸入線上蛋白相互作用檢索(STRING)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，以中度相互作用可信度為條件構(gòu)建蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI網(wǎng)絡(luò))。下載PPI網(wǎng)絡(luò)信息并導(dǎo)入Cytoscape軟件中利用cytoHubba插件分析預(yù)測(cè)該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及關(guān)鍵基因[10-11]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 GSE63742原始數(shù)據(jù)利用R語(yǔ)言“affyPLM”及“affy”包對(duì)背景進(jìn)行校正及標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過“l(fā)imma”包進(jìn)行t檢驗(yàn)并根據(jù)設(shè)定閾值篩選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的DEGs。KEGG及GO富集分析采用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)在線統(tǒng)計(jì)學(xué)工具進(jìn)行分析。Cytoscape軟件中利用cytoHubba插件進(jìn)行最大團(tuán)中心性(MCC)的統(tǒng)計(jì)分析[11]。

2 結(jié) 果

2.1芯片質(zhì)量驗(yàn)證 穩(wěn)定的芯片質(zhì)量是保證后續(xù)分析可靠的基礎(chǔ)，RLE和NUES箱線圖可反映平行實(shí)驗(yàn)的一致性，RNA降解圖可反映芯片質(zhì)量，若某個(gè)芯片的箱線圖或者降解圖出現(xiàn)較大偏差則表明該芯片存在問題。結(jié)果表明納入芯片的REL及NUSE箱線圖結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1A、1B。RNA降解是影響芯片質(zhì)量的重要因素，因其從5′開始降解，所以5′的熒光強(qiáng)度要低于3′，利用RNA降解曲線觀察各個(gè)芯片RNA降解趨勢(shì)是否存在一致性。圖1C顯示納入分析芯片的5′端較3′端降解明顯，各組之間趨勢(shì)相對(duì)平行，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上述分析均表明納入本研究的芯片質(zhì)量?jī)?yōu)秀，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，可為后續(xù)分析提供可靠數(shù)據(jù)。

2.2DEGs篩選 對(duì)芯片樣本進(jìn)行主成分分析(PCA)，結(jié)果提示兩組差異較大具備明顯特異性，見圖2A。對(duì)DEGs進(jìn)行聚類分析提示組內(nèi)差異較小可重復(fù)性良好，PH組基因表達(dá)模式與假手術(shù)組有明顯區(qū)別，見圖2B。將芯片數(shù)據(jù)歸一化處理后共篩選出上調(diào)基因70個(gè)，下調(diào)基因66個(gè)，共計(jì)136個(gè)DEGs，結(jié)果用火山圖進(jìn)行展示，見圖2C，上調(diào)和下調(diào)最顯著的前10個(gè)DEGs具體信息見表1。

2.3DEGs的KEGG和GO富集分析 DEGs的KEGG可視化分析結(jié)果表明，LR終止階段大量DEGs與類固醇激素合成、維生素A代謝、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等共7條信號(hào)及代謝通路密切相關(guān)。GO富集分析結(jié)果表明，在生物學(xué)過程中，DEGs主要與Notch信號(hào)通路負(fù)向調(diào)控、環(huán)氧酶P450通路以及IL-8分泌正向調(diào)控等過程相關(guān)；在細(xì)胞組分層面，主要與細(xì)胞外區(qū)域、基底外側(cè)膜、外泌體以及細(xì)胞器膜等結(jié)構(gòu)相關(guān)；在分子功能上主要和芳香酶活性、小分子結(jié)合、花生四烯酸環(huán)氧酶活性以及類固醇羥化酶活性等分子功能相關(guān)。 見圖3。

注：A為RLE箱線圖；B為NEUS箱線圖；C為RNA降解圖。

圖1 基因芯片質(zhì)量驗(yàn)證

注：A為假手術(shù)組與PH組的PCA分析；B為火山圖，黑色代表非DEGs，紅色代表上調(diào)DEGs，綠色代表下調(diào)DEGs；C為DEGs聚類熱圖。

圖2 PH組與假手術(shù)組的PCA分析及DEGs篩選

表1 PH組與假手術(shù)組DEGs上調(diào)和下調(diào)最顯著的前10個(gè)基因詳細(xì)信息

續(xù)表1 PH組與假手術(shù)組DEGs上調(diào)和下調(diào)最顯著的前10個(gè)基因詳細(xì)信息

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)以及Cytoscape軟件分析可進(jìn)一步明確DEGs所涉及的蛋白相互作用及其中參與調(diào)控的關(guān)鍵基因。結(jié)果顯示，該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中包括67個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白的46種關(guān)系，其中多數(shù)蛋白間都存在相互作用關(guān)系。采用cytoHubba插件在該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中共篩選關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和基因，排名前10位的關(guān)鍵基因依次為Cyp2c13、ste2、Mup5、LOC259244、Rup2、Hsd3b5、UST4r、Btg2、Cyp2c11、Myc。見圖4。

注：A為KEGG；B為生物學(xué)過程；C為細(xì)胞組分；D為分子功能。

圖3 DEGs的KEGG及GO富集分析

注：A為PPI網(wǎng)絡(luò)；B為排位前10的關(guān)鍵基因。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

3 討 論

在增殖階段，LR與肝臟腫瘤都表現(xiàn)為肝細(xì)胞強(qiáng)大的增殖能力。但由于腫瘤細(xì)胞缺乏終止的負(fù)向調(diào)控機(jī)制，其細(xì)胞可以進(jìn)行無限分裂。而LR是一個(gè)受多因素調(diào)節(jié)復(fù)雜而精密的過程，當(dāng)再生程度能夠滿足機(jī)體代謝需求時(shí)，會(huì)觸發(fā)終止信號(hào)停止細(xì)胞增殖。本研究選取LR終止階段的大鼠肝臟基因芯片共篩選136個(gè)DEGs并對(duì)其進(jìn)行KEGG和GO富集分析試圖揭示上述基因在LR終止階段所發(fā)揮的作用。在KEGG分析所篩選出的7條通路中，MAPK和TGF-β信號(hào)通路最值得關(guān)注。MAPK家族是一組能被多種細(xì)胞外刺激活化的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激以及炎性反應(yīng)等多種重要的生理/病理過程。而CAMPBELL等[14]研究報(bào)道了p38作為MAPK亞族在增殖中發(fā)揮作用與肝細(xì)胞所處的病理生理環(huán)境密切相關(guān)，該研究表明p38α是肝細(xì)胞增殖的負(fù)向調(diào)控因子，在肝細(xì)胞特異性敲除p38α的小鼠PH術(shù)后LR模型中，LR早期表現(xiàn)為增殖活性增強(qiáng)，其機(jī)制可能與p38α拮抗JNK-c-Jun通路活性有關(guān)。在慢性膽汁性肝硬化模型中，特異性敲除肝細(xì)胞p38α?xí)?dǎo)致有絲分裂阻滯以及細(xì)胞質(zhì)分裂失敗，從而減少肝細(xì)胞增殖最終降低了小鼠壽命[15]。FORTIER等[16]通過CCl4碳誘導(dǎo)的急性肝損傷模型表明，特異性敲除肝細(xì)胞p38α改變了損傷后免疫微環(huán)境使炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增強(qiáng)，通過CCl2/CCl5細(xì)胞因子的趨化作用有利于肝組織修復(fù)的免疫微環(huán)境形成。有研究表明，TGF-β信號(hào)通路是抑制肝細(xì)胞增殖的重要信號(hào)，因此其與肝星狀細(xì)胞(HSCs)活化密切相關(guān)[13]。HSCs作為肝臟微環(huán)境中最重要的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)分化為成肌纖維細(xì)胞(MFs)后參與了肝纖維化、HCC以及LR等病理生理過程，抑制TGF-β通路干擾了LR過程中HSCs的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減少了β-catenin核聚集以及細(xì)胞色素P450表達(dá)，最終導(dǎo)致增殖延遲，而該通路活化可直接促進(jìn)肝纖維化[17-18]。一項(xiàng)關(guān)于HCC轉(zhuǎn)錄組分析表明，40%樣本存在TGF-β信號(hào)通路基因突變，該通路上調(diào)會(huì)促進(jìn)炎癥和纖維化，下調(diào)則會(huì)降低腫瘤抑制活性，顯著縮短患者生存時(shí)間[19]。Notch信號(hào)通路具有促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的作用，過表達(dá)Notch-1可以上調(diào)cyclin A1、D1、E等細(xì)胞周期蛋白表達(dá)[20]；肝母細(xì)胞中Notch通路活化在肝穩(wěn)態(tài)、代謝、再生、血管生理以及膽道形態(tài)成形方面發(fā)揮了作用[21]；PH術(shù)后肝臟Notch通路明顯活化，抑制該通路可導(dǎo)致細(xì)胞周期及其相關(guān)蛋白失調(diào)，所涉及機(jī)制可能與NICD/Akt/HIF-1α通路有關(guān)[22]。肝細(xì)胞來源的外泌體可在再生過程中促進(jìn)細(xì)胞間通訊，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可經(jīng)Wnt/β-catenin通路抑制HSCs活化從而減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化[23-24]。而在LR終止階段，DEGs的分子功能為激活包括芳香化酶、類固醇羥化酶在內(nèi)的多種代謝相關(guān)酶活性，也預(yù)示著肝臟最重要的代謝功能已經(jīng)恢復(fù)。

在PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出前10 位與LR終止階段相關(guān)的關(guān)鍵基因較假手術(shù)組均表達(dá)上調(diào)。Cyp2c11及Cyp2c13是編碼大鼠細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)的基因，該系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要存在于線粒體和微粒體，與大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)及外源性物質(zhì)的代謝密切相關(guān)[25]。上述基因分別與人Cyp2c9及Cyp2c19基因具有高度相似性，而后者是體外培養(yǎng)肝細(xì)胞及人工肝組織構(gòu)建產(chǎn)生生理功能的標(biāo)記[25-26]。LOC259244是編碼大鼠α2u-球蛋白的基因，該蛋白僅在雄性大鼠的肝臟中合成[27]。因此有理由推斷Cyp2c11、Cyp2c13以及LOC259244基因表達(dá)上調(diào)是LR晚期肝臟代謝功能恢復(fù)的標(biāo)志，但目前關(guān)于上述基因在LR中的作用少有文獻(xiàn)報(bào)道，其如何參與LR終止階段的調(diào)控更有待進(jìn)一步探討。ste2基因編碼雌激素磺基轉(zhuǎn)移酶2，后者通過磺化和滅活雌激素來維持雌激素穩(wěn)態(tài)。研究證實(shí)，雌激素可經(jīng)過G蛋白耦聯(lián)雌激素受體1(GPER1)經(jīng)Akt-mTOR通路促進(jìn)斑馬魚及人類肝細(xì)胞增殖[28]，因此，該基因在LR終止階段上調(diào)可能是通過加強(qiáng)雌激素滅活從而間接下調(diào)Akt-mTOR通路活性來發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。Hsd3b5基因在所有類固醇激素的生物合成中都發(fā)揮至關(guān)重要的作用。ZHAO等[29]研究表明，肝臟發(fā)育早期階段的腫瘤樣生長(zhǎng)受到α2u-球蛋白(細(xì)胞外區(qū)域)、ppp2r2a-pik3c3(MAPK信號(hào)通路)、Hsd3b5(代謝通路)三者的正負(fù)協(xié)調(diào)作用。值得關(guān)注的是作為促癌基因的Myc在LR終止階段表達(dá)水平仍然上調(diào)，當(dāng)肝細(xì)胞核因子4α(HNF4α)缺失引起的c-Myc持續(xù)過表達(dá)最終會(huì)導(dǎo)致PH術(shù)后肝臟無功能的持續(xù)增殖[30]。這也間接證實(shí)了在該階段必然存在一系列對(duì)抗其促增殖作用的負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)。在肝細(xì)胞中Btg2作為細(xì)胞周期抑制劑可阻止FoxM1活化來抑制DNA合成[31]。MiR-6875-3p可直接抑制Btg2表達(dá)來上調(diào)FAK/Akt通路活性從而促進(jìn)HCC浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[32]。PRMT5可通過ERK通路介導(dǎo)Btg2表達(dá)下調(diào)來促進(jìn)腫瘤增殖[33]。上述研究結(jié)果證實(shí)了部分關(guān)鍵基因在LR終止階段的正向及負(fù)向作用，但關(guān)于Mup5、Rup2以及UST4r基因在LR及HCC中作用的相關(guān)報(bào)道較少，有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，LR是受多因素調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程，在終止階段能根據(jù)機(jī)體需求停止增殖并產(chǎn)生有功能的肝細(xì)胞是其區(qū)別于肝臟腫瘤增殖的主要特點(diǎn)。本文成功篩選出大鼠LR終止階段肝組織DEGs并對(duì)其進(jìn)行分析，初步了解其涉及的相關(guān)功能以及信號(hào)通路。同時(shí)還分析出ste2、Btg2、Hsd3b5等具有負(fù)向調(diào)控作用的hub基因，為肝臟腫瘤研究靶點(diǎn)的篩選以及病理機(jī)制的探討提供了新的思路。