汪文明，馬 玲，周 靖，陳 林△

1.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 408400；2.重慶市南川區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，重慶 408400

地中海貧血(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“地貧”)是全球最大的單基因遺傳病之一，我國(guó)南方高發(fā)地區(qū)人群攜帶率為1%～23%[1]?；驒z測(cè)是診斷該病和確定基因型的準(zhǔn)確方法[2]。目前臨床應(yīng)用最為廣泛的基因檢測(cè)方法是反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，該方法成本低，通量高，適合在基層實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，但檢測(cè)過(guò)程煩瑣，手工操作步驟多，檢測(cè)周期長(zhǎng)，缺少陽(yáng)性質(zhì)控品，是該方法不可忽視的問(wèn)題。《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量與能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的指南》要求，基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)部質(zhì)量控制至少需做陰陽(yáng)性質(zhì)控[3]。目前，分子檢測(cè)的商品化質(zhì)控物有限，且存在檢測(cè)位點(diǎn)單一，無(wú)法覆蓋全部突變位點(diǎn)，不能參與整個(gè)檢測(cè)過(guò)程等問(wèn)題，較多實(shí)驗(yàn)室使用自制質(zhì)控品[4]。在病原微生物核酸檢測(cè)方面，葛燕梅等[5]使用已確認(rèn)的解脲支原體陽(yáng)性標(biāo)本作為單一質(zhì)控物；另外，部分實(shí)驗(yàn)室使用商品化試劑自制復(fù)合質(zhì)控品[6-8]。在遺傳性疾病的基因檢測(cè)項(xiàng)目中，自制復(fù)合質(zhì)控品的使用鮮有報(bào)道。本研究探討使用陽(yáng)性標(biāo)本混合制作復(fù)合質(zhì)控品，以期覆蓋更多的突變位點(diǎn)，并對(duì)該方法的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1材料 收集2017年9月至2018年12月在南川區(qū)人民醫(yī)院行α、β-地貧檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本，標(biāo)本類(lèi)型為枸櫞酸鈉抗凝的外周全血。日常檢測(cè)工作中，選取DNA水平為20～40 ng/μL，純度A260/A280值為1.5～2.5的單一突變類(lèi)型的雜合子標(biāo)本，于-70 ℃冰箱保存，建立陽(yáng)性標(biāo)本庫(kù)。本研究經(jīng)過(guò)南川區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受檢者知情同意。

1.2儀器與試劑 α、β-地貧基因檢測(cè)試劑盒(潮州凱普公司)，NanoDrop 2000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(賽默飛公司)，Veriti熱循環(huán)儀(美國(guó)應(yīng)用公司)，HB-2012A型醫(yī)用核酸分子快速雜交儀(潮州凱普公司)。

1.3方法

1.3.1陽(yáng)性標(biāo)本的選擇 選擇陽(yáng)性標(biāo)本時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室使用的檢測(cè)方法及檢測(cè)基因位點(diǎn)而定，應(yīng)盡可能覆蓋PCR產(chǎn)物的所有片段。南川區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(以下稱(chēng)“本實(shí)驗(yàn)室”)采用潮州凱普公司生產(chǎn)的α、β-地貧基因檢測(cè)試劑，該試劑使用單管法，使用3對(duì)半引物擴(kuò)增α-地貧的3種突變位點(diǎn)和3種缺失型位點(diǎn)(圖1)及1對(duì)引物擴(kuò)增β-地貧的17個(gè)位點(diǎn)的19種突變類(lèi)型。因此，本研究制備的復(fù)合質(zhì)控品，使用2種不同的α-地貧突變位點(diǎn)和2種不同的β-地貧突變位點(diǎn)。在制備質(zhì)控品時(shí)，可使用不同的突變位點(diǎn)自由組合，以達(dá)到同一批次試劑覆蓋所有常見(jiàn)突變位點(diǎn)的目的。

圖1 α-地貧基因引物位置模式圖(潮州凱普公司提供)

1.3.2復(fù)合質(zhì)控品制備 按照上述要求，從-70 ℃陽(yáng)性標(biāo)本庫(kù)中，選取4種不同突變類(lèi)型的陽(yáng)性標(biāo)本，室溫充分融化。分別取1 mL加入10 mL無(wú)菌離心管內(nèi)，震蕩混勻，瞬時(shí)離心，制成復(fù)合質(zhì)控品，分別分裝200 μL于1.5 mL EP管內(nèi)，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每次試?yàn)前，取1支在室溫下復(fù)融20 min，充分混勻后，與待測(cè)標(biāo)本一起檢測(cè)。

根據(jù)α、β-地貧基因試劑的檢測(cè)要求，全血標(biāo)本加樣量為200 μL時(shí)，提取DNA的水平為20～40 ng/μL，DNA純度A260/A280的值為1.5～2.5，且試劑盒的DNA最低檢出限為2 ng/μL。通過(guò)等比例混合4種不同突變類(lèi)型陽(yáng)性標(biāo)本的方法，制備復(fù)合質(zhì)控品，每種突變類(lèi)型陽(yáng)性標(biāo)本的加樣量為50 μL，混合后總體積為200 μL，理論上每種突變的DNA水平為5～10 ng/μL，此水平符合弱陽(yáng)性質(zhì)控品的水平要求(最低檢測(cè)量的2～5倍)[6-8]。

1.3.3自制質(zhì)控品檢測(cè)及結(jié)果判讀 自制復(fù)合質(zhì)控品與待測(cè)標(biāo)本一起，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，使用離心柱法提取DNA，使用NanoDrop 2000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)DNA提取液的水平和純度(試劑盒要求水平為20～40 ng/μL，純度A260/A280比值為1.5～2.5)。PCR反應(yīng)體系為50 μL，45 μL PCR混合液，5 μL DNA提取液。使用Veriti熱循環(huán)儀行基因擴(kuò)增。使用HB-2012A型醫(yī)用核酸分子快速雜交儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物行導(dǎo)流雜交，擴(kuò)增產(chǎn)物和雜交膜條上的不同突變類(lèi)型的探針雜交，通過(guò)化學(xué)顯色對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，見(jiàn)圖2。因α、β-地貧基因突變位點(diǎn)較多，1個(gè)復(fù)合質(zhì)控品最多可監(jiān)控4個(gè)突變位點(diǎn)，為監(jiān)控更多的突變位點(diǎn)，下次檢測(cè)可改用與上次不同的復(fù)合質(zhì)控品。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Microsoft Excel2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。

2 結(jié) 果

使用自制復(fù)合質(zhì)控品監(jiān)控126次，同時(shí)使用含有單一突變位點(diǎn)(-α3.7)的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行對(duì)照。126次檢測(cè)中，使用自制復(fù)合質(zhì)控品和單一突變陽(yáng)性標(biāo)本提取的DNA，其水平及純度均滿(mǎn)足試劑盒要求，見(jiàn)表1。反向斑點(diǎn)雜交結(jié)果中，每陽(yáng)性位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)均成功顯色，見(jiàn)圖2。126次檢測(cè)中，共監(jiān)測(cè)陽(yáng)性位點(diǎn)數(shù)504次，檢出率為100.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%，陰性預(yù)測(cè)值為0。檢測(cè)陽(yáng)性位點(diǎn)基本覆蓋本地區(qū)所有常見(jiàn)突變位點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 自制復(fù)合質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果

注：k為雜交膜條上不同探針的分布示意圖，圖中每個(gè)小方格內(nèi)的含有1種探針，左下角1個(gè)小方格無(wú)探針?lè)植迹?行和倒數(shù)第2行有“N”標(biāo)記的小方格，代表野生型探針，其中 “NP”為“--SEA、-α3.7、-α4.2”共用的野生型對(duì)照點(diǎn)，“M”標(biāo)記的小方格代表突變型探針；a～j為10種自制復(fù)合質(zhì)控品對(duì)應(yīng)的10張不同的雜交膜條，藍(lán)色斑點(diǎn)代表質(zhì)控品擴(kuò)增產(chǎn)物與相應(yīng)的探針行反向斑點(diǎn)雜交的結(jié)果。

圖2 自制復(fù)合質(zhì)控品反向斑點(diǎn)雜交結(jié)果

3 討 論

室內(nèi)質(zhì)控的目的在于監(jiān)控檢測(cè)過(guò)程，評(píng)價(jià)檢驗(yàn)結(jié)果是否可靠，以排除所有階段中導(dǎo)致不滿(mǎn)意的原因。分子檢測(cè)技術(shù)飛速發(fā)展，越來(lái)越多的醫(yī)院開(kāi)設(shè)有分子檢測(cè)項(xiàng)目，然而分子檢測(cè)的室內(nèi)質(zhì)控卻未完善[9-10]，特別是室內(nèi)質(zhì)控物質(zhì)的缺少，給實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展分子檢測(cè)帶來(lái)困難。呂榮鈺等[11]對(duì)反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)為陰性的地貧疑似病例，再進(jìn)一步行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有1.8%的漏診率，對(duì)于漏診的原因，文章并未詳述，筆者認(rèn)為該方法缺少陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)實(shí)驗(yàn)全過(guò)程進(jìn)行有效監(jiān)控，是該方法存在的缺陷。在缺乏商品化陽(yáng)性質(zhì)控品情況下，實(shí)驗(yàn)室多采用已確認(rèn)的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)控，也有部分實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行基因型檢測(cè)時(shí)，常年僅使用一個(gè)基因型室內(nèi)質(zhì)控品，未對(duì)其他有臨床決策價(jià)值的基因突變進(jìn)行監(jiān)控[9]。李艷等[12]提出當(dāng)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變基因時(shí)，可設(shè)立2個(gè)或3個(gè)突變基因的陽(yáng)性對(duì)照，下次改用與上次不同的突變基因，以便覆蓋更多突變位點(diǎn)。筆者受到以上研究的啟發(fā)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室積累的質(zhì)控經(jīng)驗(yàn)，以α、β-地貧基因檢測(cè)為例，通過(guò)混合陽(yáng)性標(biāo)本，自制復(fù)合質(zhì)控品的方法，對(duì)檢測(cè)全過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控。結(jié)果顯示，2017年9月至2018年12月使用自制質(zhì)控品檢測(cè)126次，檢測(cè)陽(yáng)性位點(diǎn)數(shù)504次，檢出率為100.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%，陰性預(yù)測(cè)值為0。檢測(cè)陽(yáng)性位點(diǎn)基本覆蓋本地區(qū)所有常見(jiàn)突變位點(diǎn)。

與商品化質(zhì)控品相比，自制質(zhì)控品原料有限，且每個(gè)標(biāo)本間也存在差異，不同批次質(zhì)控品間也會(huì)存在差異，因此，需要對(duì)納入陽(yáng)性標(biāo)本庫(kù)的標(biāo)本進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控，不得使用DNA水平及純度低，含有凝塊等不合格的標(biāo)本。應(yīng)用過(guò)程發(fā)現(xiàn)以下缺陷：(1)質(zhì)控品4個(gè)陽(yáng)性位點(diǎn)的顯色，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)深淺不均一的情況，可能與某一標(biāo)本產(chǎn)生微小凝塊，或凍存標(biāo)本未完全融化有關(guān)。因此，在制備質(zhì)控品時(shí)，每個(gè)標(biāo)本要充分融化，若遇到有較小凝塊時(shí)，可參照文獻(xiàn)[13]的方法，使用無(wú)菌小木棍，將凝塊搗碎，震蕩混勻，然后再與其他不同突變類(lèi)型的陽(yáng)性標(biāo)本混合。(2)陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)凍存、室溫溶解、混勻、震蕩等操作后，標(biāo)本物理性狀發(fā)生較大改變，顯微鏡下觀察，無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，DNA呈游離狀態(tài)，易降解。因此，選擇陽(yáng)性標(biāo)本時(shí)，建議使用近1～2個(gè)月內(nèi)檢出的標(biāo)本。(3)4元復(fù)合質(zhì)控品，每個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本的加樣量約為常規(guī)加樣量的1/4，若某一陽(yáng)性標(biāo)本DNA水平較低，或者因?yàn)闃?biāo)本凝集等原因，導(dǎo)致DNA的提取量減少，若低于試劑盒檢測(cè)下限時(shí)，可能會(huì)遇到某一位點(diǎn)未檢出的情況。若同一批次同一位點(diǎn)多次出現(xiàn)未檢出的情況，應(yīng)屬于質(zhì)控品原因?qū)е碌氖Э?。因此，在制備質(zhì)控品時(shí)，可增加同種突變的陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)，等比例混勻后，再與其他不同突變類(lèi)型的陽(yáng)性標(biāo)本混合，以彌補(bǔ)因單一標(biāo)本的質(zhì)量不佳造成的影響。(4)多重PCR不同引物間存在著競(jìng)爭(zhēng)作用[14]，某些潛在擴(kuò)增效率低的引物其擴(kuò)增效率會(huì)有所降低，導(dǎo)致某個(gè)突變未檢出，或檢出比例降低的情況。本研究還未發(fā)現(xiàn)未檢出的情況，可能與本研究數(shù)據(jù)較少有關(guān)，有待進(jìn)一步觀察。(5)與商品化質(zhì)控品相比，自制質(zhì)控品的配置過(guò)程相對(duì)比較粗糙，在穩(wěn)定性、瓶間差等方面，無(wú)法達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化的要求[15]，因此，在發(fā)現(xiàn)自制質(zhì)控品未檢出等情況時(shí)，應(yīng)首先排除自制質(zhì)控品本身的原因。(6)因區(qū)域性陽(yáng)性標(biāo)本類(lèi)型的限制[16]，無(wú)法獲取一些稀有型突變的標(biāo)本，本方法僅可監(jiān)控本地區(qū)常見(jiàn)突變類(lèi)型。

我國(guó)α、β-地貧發(fā)病率較高，陽(yáng)性標(biāo)本易獲得，本研究制備的復(fù)合質(zhì)控品，制備方法簡(jiǎn)單，成本低，可有效監(jiān)控更多突變位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室使用該方法進(jìn)行質(zhì)控，穩(wěn)定性良好，在商品化質(zhì)控品不太成熟的情況下，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況自行制備。