孫宜新,胡 洪,吳學(xué)壯,聞愛友

(安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

大葉枸是近年雜交培育出的一種新型非常規(guī)飼草，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和再生能力，且鮮草年產(chǎn)量大、蛋白含量高、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)[1]。因此，將大葉枸作為一種飼料資源合理開發(fā)利用，對擴(kuò)大畜禽蛋白飼糧來源，緩解我國蛋白飼料資源短缺，降低畜禽生產(chǎn)成本，促進(jìn)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要的意義。研究表明大葉枸的細(xì)枝條和樹葉雖含有較高蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，但因其含有較高ADF和NDF，且適口性較差而直接影響其作為畜禽飼料的使用[2]。近年來，隨著發(fā)酵技術(shù)和微生物添加劑在現(xiàn)代飼料生產(chǎn)中的開發(fā)應(yīng)用，采用微生物制劑發(fā)酵處理，可有效降解植物性飼料的細(xì)胞壁和纖維素，改善飼料原料的適口性和營養(yǎng)價(jià)值[3-6]。本研究以大葉枸莖葉為底物，分別接種純培養(yǎng)的乳酸菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合菌種，測定了不同菌種發(fā)酵前后大葉枸的營養(yǎng)成分及發(fā)酵后有益菌含量等指標(biāo)，并分析了影響其變化的因素，旨在為大葉枸發(fā)酵合理篩選菌株及客觀評價(jià)大葉枸營養(yǎng)價(jià)值提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料及菌種

新鮮整株大葉枸于2019年7月采自安徽圣達(dá)生態(tài)養(yǎng)殖有限公司，烘干粉碎至60目備用;乳酸菌和枯草芽孢桿菌均為安徽科技學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)與飼料學(xué)實(shí)驗(yàn)室篩選保存菌種;蔗糖為市購。

1.2 試驗(yàn)分組與發(fā)酵

1.2.1 發(fā)酵底物組成及配制 將粉碎后的大葉枸粉、蔗糖、水按58%、4%、38%配比稱量，蔗糖溶于水中，將蔗糖液噴灑在大葉枸粉上，充分混均后，將大葉枸混合物均分為4份，待用。

1.2.2 發(fā)酵方法 取一定量的枯草芽孢桿菌、乳酸菌按1∶1的比例先混合均勻成復(fù)合菌株菌粉，然后分別將枯草芽孢桿菌、乳酸菌、復(fù)合菌株菌粉放入45 ℃溫水中，活化2 h，制成菌液，調(diào)節(jié)pH值為6.5。

在上述每組份的大葉枸混合物中，C組(對照組)按0.1%添加不含任何菌種的蒸餾水，BB組和LB組分別按0.1%添加量接種活化后的枯草芽孢桿菌菌液(2×105CFU/g)、乳酸菌菌液(2×105CFU/g)，BL組按0.2%添加復(fù)合菌株菌液(2×105CFU/g)。

將4組大葉枸混合物充分拌勻后，放入密閉容器，封口并放置于30 ℃環(huán)境條件下，密閉厭氧發(fā)酵8 d。待發(fā)酵結(jié)束后，分別取一定量濕基態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物用于測定pH值和有益菌含量，其余發(fā)酵產(chǎn)物在65 ℃環(huán)境下烘干取出，涼至室溫后粉碎，待測。

1.3 測定指標(biāo)及方法

發(fā)酵后樣品中粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、NDF、ADF、鈣、磷等分別采用常規(guī)飼料分析方法測定；pH值采用精密pH計(jì)測定；發(fā)酵樣品枯草芽孢桿菌、乳酸菌等按照GB/T 26428-2010和GB/T 4789.35-2016中規(guī)定的方法進(jìn)行有益菌計(jì)數(shù)測定(CFU/g)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 19.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)和差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前大葉枸原料的營養(yǎng)成分

將新鮮大葉枸截成1～2 cm小段，經(jīng)65 ℃烘干，粉碎至60目后，分別測定各種養(yǎng)分指標(biāo)。結(jié)果見表1。

表1 大葉枸原料常規(guī)營養(yǎng)成分含量Table 1 Content of conventional nutrition of big-leaf mulberry raw material

2.2 不同菌種發(fā)酵對大葉枸營養(yǎng)成分的影響

由圖1可知，C組中除粗蛋白含量略有提高外，其它各養(yǎng)分含量與未發(fā)酵大葉枸原料均無明顯變化。添加枯草芽孢桿菌和乳酸菌促進(jìn)了大葉枸發(fā)酵過程中CF、NDF和ADF的降解，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)BL組中CF、NDF和ADF含量最低，且顯著低于其它處理組(P<0.05)，BL組CF、NDF和ADF含量分別達(dá)到11.51%、23.16%和15.87%。與對照組相比，LB組中CF、NDF和ADF含量有所下降，但差異不顯著(P>0.05)，而BB組中CF、NDF和ADF含量顯著低于C組和LB組(P<0.05)。LB組和BL組粗蛋白含量顯著高于C組和BB組(P<0.05)?？赡苁怯捎贚B組和BL組中乳酸菌數(shù)量較多，形成酸性環(huán)境，減少了粗蛋白的分解。BL組粗蛋白的含量高于LB組，可能由于BL組中枯草芽孢桿菌數(shù)量較多，發(fā)酵前期消耗大量氧氣，促進(jìn)了乳酸菌的繁殖。

圖1 不同菌種發(fā)酵對大葉枸粗蛋白、粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量的影響Fig.1 Effects of different strains fermentation on CP, CF, NDF, ADF contents in citron注：不同小寫字母表示不同菌種發(fā)酵后同一指標(biāo)間的差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同菌種發(fā)酵對大葉枸pH及相關(guān)微生物的影響

由表2可知，與發(fā)酵前相比，對照組pH、枯草芽孢桿菌和乳酸菌含量差異均不顯著(P>0.05)。相比于C組的pH值，BB組降低37.15%，LB組降低35.29%，差異均顯著(P<0.05)；BL組的pH值降低40.87%，差異極顯著(P<0.01)。BB組和LB組之間pH值差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)C組中枯草芽孢桿菌和乳酸菌含量、BB組中乳酸菌含量和LB組中枯草芽孢桿菌的含量較少，其有益菌含量的對數(shù)值均低于3.00。BL組中枯草芽孢桿菌含量比BB組提高13.10%，乳酸菌的含量比LB組提高8.57%，差異均顯著(P<0.05)。

表2 不同菌株發(fā)酵對大葉枸pH及相關(guān)微生物的影響Table 2 Effect of fermentation of different strains on pH and related microorganisms of big-leaf mulberry

3 討論與分析

CP含量是指示飼料質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，其含量越高，發(fā)酵飼料飼用價(jià)值越高。試驗(yàn)表明，大葉枸發(fā)酵添加乳酸菌處理組CP含量高于其它組。這可能是由于發(fā)酵料中添加數(shù)量較多的乳酸菌在發(fā)酵前期快速增殖，并利用底物中可溶性碳水化合物轉(zhuǎn)化形成乳酸，使pH值迅速下降，減少了CP的分解[7]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)BL組CP含量高于LB組，可能是由于BL組中枯草芽孢桿菌數(shù)量較多，發(fā)酵前期消耗大量氧氣，促進(jìn)了乳酸菌的繁殖，進(jìn)而減少了CP的分解。這與本試驗(yàn)發(fā)酵結(jié)束時(shí)BL組中乳酸菌數(shù)量高于LB組結(jié)果一致。郁馮艷等[8]在使用乳酸菌制劑青貯甜高粱的研究中發(fā)現(xiàn)，乳酸菌制劑可有效提高CP含量。姚焰礎(chǔ)等[9]研究發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌制劑在抑制其它有害細(xì)菌增長的同時(shí)，可利用發(fā)酵底物合成自身的菌體蛋白，使得發(fā)酵后CP含量升高。與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

CF、NDF和ADF含量是影響飼料可消化性的關(guān)鍵指標(biāo)，其含量越低，發(fā)酵飼料飼用價(jià)值越高[10]。本試驗(yàn)中，發(fā)酵結(jié)束時(shí)BB組和BL組的CF、NDF和ADF含量顯著低于C組。由于枯草芽孢桿菌在發(fā)酵時(shí)能分泌大量的胞外酶，如纖維素酶、淀粉酶等，能有效降解植物性飼料中的CF、NDF和ADF。熊羅英[11]利用HS3和GZ3兩種枯草芽孢桿菌發(fā)酵構(gòu)樹葉，發(fā)酵后構(gòu)樹葉中的CF含量分別降低11.68%和14.96%，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。Jones等[12]研究表明，在紫花苜蓿青貯過程中，細(xì)胞壁組分發(fā)生了變化，并且由于酸解作用使部分細(xì)胞壁多糖發(fā)生了降解。但這種在較低的pH值的酸性環(huán)境促進(jìn)了細(xì)胞壁成分的酸解作用，與添加枯草芽孢桿菌對植物纖維降解的作用相對較弱，這可能也是試驗(yàn)觀察到LB組與對照組中CF、NDF和ADF含量變化較小，而添加BB組和BL組明顯降低的原因所在。

pH值是決定發(fā)酵能否成功最直接的指標(biāo)。試驗(yàn)表明發(fā)酵8 d后，添加不同微生物菌劑的試驗(yàn)各組均較對照組pH值顯著降低，且均降至4.18以下。這與侯楠楠等[13]使用乳酸菌發(fā)酵豆粕對pH影響的研究和劉曉明[14]使用乳酸菌、枯草芽孢桿菌發(fā)酵不同飼料原料對pH的影響的研究結(jié)果相符合。研究表明添加乳酸菌促進(jìn)了乳酸發(fā)酵可直接降低了pH值；枯草芽孢桿菌在好氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生降解復(fù)雜碳水化合物的酶，將葡萄糖或乳糖轉(zhuǎn)化成乳酸等有機(jī)酸，使發(fā)酵后pH值下降。

本試驗(yàn)中復(fù)合菌種發(fā)酵組比單一菌種發(fā)酵組的有益菌含量分別提高11.59%和7.89%。這與李可義[15]的添加芽孢桿菌和乳酸菌處理組的乳酸菌含量顯著高于單獨(dú)添加乳酸菌處理組的結(jié)果相一致。湯小朋[16]在單菌和混菌兩種方式固態(tài)發(fā)酵木薯渣的研究中發(fā)現(xiàn)，單菌發(fā)酵后活菌含量低于混菌發(fā)酵。這是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌和乳酸菌具有抑菌作用，能抑制有害菌的增長，利于發(fā)酵飼料的保存，且在發(fā)酵前期枯草芽孢桿菌生長繁殖消耗大量氧氣，能促進(jìn)乳酸菌的生長繁殖。徐穎宣等[17]、GE等[18]和Zhou等[19]研究指出在單菌發(fā)酵時(shí)，微生物的代謝產(chǎn)物將大量積累，會(huì)負(fù)反饋?zhàn)柚姑割惖暮铣?，?dǎo)致單菌發(fā)酵效果低于混菌發(fā)酵，而利用混菌發(fā)酵可以解除這種負(fù)反饋。

綜上所述，添加枯草芽孢桿菌、乳酸菌及二者混合菌均可降低發(fā)酵物pH值，且混合菌添加優(yōu)于單獨(dú)添加對大葉枸粉發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)成分含量影響的效果，明顯改善了大葉枸發(fā)酵飼料的品質(zhì)。