楊 亞，朱詩蘭，范蘇婉，任 曼，李升和

(安徽科技學(xué)院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部豬肉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實驗室，動物營養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實驗室,安徽 鳳陽 233100)

蜂花粉(Bee pollen)，是蜜蜂從顯花植物花蕊內(nèi)采集的花粉粒，加入了特殊的腺體分泌物混合而成的一種不規(guī)則團(tuán)狀物[1]，含有豐富的蛋白質(zhì)、游離氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、礦物元素和多種生物活性酶等[2]。研究表明，蜂花粉具有促進(jìn)生長、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、抗氧化、抗癌和抗動脈粥樣硬化等多種生物功能和藥理作用[3]。

腸道是機(jī)體重要的免疫和消化器官[4]，其巨大的表面積和豐富的淋巴組織在整體免疫中扮演著重要角色，直接或間接影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及機(jī)體免疫功能，正常的腸道結(jié)構(gòu)功能是動物機(jī)體健康的保證[5]。方小明等[6]研究發(fā)現(xiàn)，荷花蜂花粉能夠改善5-氟尿嘧啶造成的結(jié)腸粘膜損傷以及腸道傳輸功能失調(diào)。卜凡方[7]研究發(fā)現(xiàn)，便秘可能會導(dǎo)致小腸絨毛受壓迫，影響營養(yǎng)吸收功能，攝取油菜蜂花粉對此現(xiàn)象有所改善。王允超等[8]研究發(fā)現(xiàn)，破壁蜂花粉能調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進(jìn)乳酸菌等有益菌生長，降低腸道pH，改善腸道內(nèi)環(huán)境。目前，圍繞蜂花粉開展的研究主要在于其營養(yǎng)成分、對正常動物的生產(chǎn)性能和免疫功能的影響。而對腸組織損傷模型的影響研究較少。因此，本試驗以地塞米松(Dexamethasone，DEX)建立的腸組織損傷模型小鼠為試驗對象，研究不同濃度的蜂花粉對腸組織損傷小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)的影響，以期為蜂花粉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 6周齡清潔級昆明系健康小鼠60只，體重18～25 g，購于江蘇省南京市青龍山實驗動物繁殖場，合格證號：SCXK(滬)2018-0004。

1.1.2 試驗藥物 地塞米松磷酸鈉注射液(山西省芮城科龍獸藥有限公司，批準(zhǔn)文號：獸藥字040192530)；破壁蜂花粉(安徽省宿松縣劉氏蜂產(chǎn)品有限責(zé)任公司),純度≥98%。

1.2 試驗方法設(shè)計

清潔級6周齡健康小鼠60只，體重18～25 g，隨機(jī)分為空白對照組、模型組和實驗Ⅰ～Ⅳ組，每組10只，雌雄各半。第1～7天，模型組和試驗Ⅰ～Ⅳ組連續(xù)隔日注射地塞米松(40 mg/kg)4次塑造模型，第8～22天Ⅰ～Ⅳ組分別飲用添加0.357、0.714、1.071、1.429 mg/mL蜂花粉的水，空白對照組和模型組飲用蒸餾水。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度25～27 ℃, 濕度55%～63%, 光照12 h。自由飲水和采食(飼喂基礎(chǔ)日糧)。

1.3 樣品采集與處理

試驗期22 d，禁食不禁水12 h后，吸入乙醚麻醉處死小鼠，取小腸各段，立即置于4%多聚甲醛固定保存；制作組織蠟塊；切片；HE染色；封片；用BA410型生物顯微鏡，采集小腸各段切片結(jié)構(gòu)，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行測量。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

2 結(jié)果

2.1 蜂花粉對模型小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響

2.1.1 蜂花粉對小鼠十二指腸組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響 由圖1可見，與對照組相比腹腔注射地塞米松導(dǎo)致小鼠十二指腸腸絨毛數(shù)量減少，存在腸絨毛粘連現(xiàn)象，小腸腺損傷嚴(yán)重，腸上皮缺損，隱窩加深，而對照組的腸絨毛排列整齊，呈柱狀，環(huán)形皺襞較多，結(jié)構(gòu)完整，隱窩深淺適度。與模型組和對照組相比，試驗Ⅰ組絨毛增長，寬度變寬，隱窩較明顯，無粘連現(xiàn)象；試驗Ⅱ組絨毛數(shù)量變多，絨毛增粗，隱窩深度變淺；試驗Ⅲ組絨毛最為發(fā)達(dá)，絨毛細(xì)長，排列緊密，隱窩明顯變淺，排列緊湊；試驗Ⅳ組絨毛密度明顯增大，長度增加。綜合觀察，試驗Ⅲ、Ⅳ組的十二腸絨毛高度均比試驗Ⅰ、Ⅱ組高，隱窩深度均比Ⅰ、Ⅱ組低，效果明顯。

A:空白對照組 B:地塞米松處理組 C～F:地塞米松+蜂花粉試驗Ⅰ～Ⅳ組圖1 蜂花粉對小鼠十二指腸組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，100×)Fig.1 Effects of bee pollen on duodenal tissue structure in mice (HE staining, 100×)

2.1.2 蜂花粉對小鼠空、回腸組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響 蜂花粉對小鼠空腸、回腸組織結(jié)構(gòu)的影響見圖2。顯微觀察可見，模型組的腸絨毛低矮，數(shù)量減少，排列較稀疏，絨毛頂端上皮細(xì)胞脫落，隱窩深度變淺；對照組的腸絨毛呈柱狀，絨毛粗短，排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，隱窩較淺。與對照組和模型組相比，試驗各組絨毛均有所增長，寬度變寬，隱窩較明顯；綜合比較試驗Ⅲ組絨毛細(xì)長，排列緊密且整齊，隱窩明顯加深，數(shù)量增多，排列緊湊，效果最佳。

A:空白對照組；B:地塞米松處理組；C～F:地塞米松+蜂花粉試驗Ⅰ～Ⅳ組圖2 蜂花粉對小鼠空腸組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，100×)Fig.2 Effects of bee pollen on jejunal tissue structure in mice (HE staining, 100×)

2.2 蜂花粉對模型小鼠小腸絨毛的影響

2.2.1 蜂花粉對小鼠十二指腸絨毛的影響 蜂花粉對小鼠十二指腸絨毛的影響見圖3。與對照組相比，模型組十二指腸絨毛高度較空白對照組顯著降低了20%。與空白對照組和模型組相比，各試驗組絨毛高度均有所增高，其中試驗Ⅲ組分別極顯著升高了34%和67%。試驗組間相比較，試驗Ⅲ組十二指腸絨毛高度顯著性高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組(P<0.05)。

與對照組相比，模型組小鼠十二指腸的隱窩深度極顯著上升了64%。與對照組和模型組相比，試驗Ⅲ組分別極顯著降低了33%、59%；試驗Ⅳ組較對照組升高了10%，差異不顯著。試驗組間相比較，其中試驗Ⅲ組隱窩深度顯著性低于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組。綜合比較，試驗Ⅲ組蜂花粉濃度對小鼠十二指腸組織結(jié)構(gòu)的保護(hù)和促進(jìn)作用最好，與組織結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果一致。

加入工作室要端正動機(jī)，如果是僅僅是停留在尋找安慰和困難求助的層面，工作室的作用不大；如果是以渴望成長，深度參與，承擔(dān)主要任務(wù)為動機(jī)，工作室會是你成長的最佳平臺。

2.2.2 蜂花粉對小鼠空腸絨毛的影響 蜂花粉對小鼠空腸絨毛和隱窩的影響見圖4，模型組的絨毛高度較對照組下降了4.93%；試驗Ⅱ組的絨毛高度較對照組和模型組分別升高了19.82%、23.78%，差異均具有極顯著性；試驗Ⅲ組的絨毛高度較對照組和模型組分別升高了25.16%、28.85%，差異均具有極顯著性；試驗Ⅳ組的絨毛高度較對照組和模型組分別升高了2.60%和7.42%，和模型組相比差異顯著。

圖4 蜂花粉對小鼠空腸絨毛的影響Fig.4 Effect of bee pollen on jejunum villi in mice

模型組的小鼠空腸隱窩深度較對照組極顯著的降低了16.29%；試驗Ⅰ組的空腸隱窩深度較對照組和模型組分別升高了2.68%、18.53%，試驗Ⅱ組的空腸隱窩深度較對照組和模型組分別升高了3.8%、19.49%；試驗Ⅲ組的隱窩深度較對照組與模型組分別升高了6.33%、21.59%；同對照組及模型組相比，試驗Ⅳ組的空腸隱窩深度分別升高了3.26%和19.02%。綜合來看，蜂花粉對空腸絨毛的保護(hù)作用明顯，但是對腸隱窩的促進(jìn)作用不明顯，可能跟蜂花粉的吸收部位有關(guān)。

2.2.3 蜂花粉對小鼠回腸絨毛的影響 蜂花粉對小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)的影響見圖3，與對照組相比，模型組的絨毛高度降低了8%，差異極顯著；試驗Ⅲ組的絨毛高度較對照組和模型組分別升高了21%、31%，均具有極顯著性差異(P<0.001)；試驗Ⅳ組的絨毛高度較對照組和模型組分別升高了9%和19%，差異均具有極顯著性(P<0.001)。

模型組的小鼠回腸的隱窩深度與空白對照組的相比降低了7%；試驗Ⅰ組的回腸隱窩深度較對照組和模型組分別升高了5%、13%；試驗Ⅱ組的腸隱窩深度較對照組的下降了0.4%，較模型組的隱窩深度上升了8%；試驗Ⅲ組的隱窩深度較對照組與模型組分別升高了10%、19%。綜合分析，與空腸結(jié)果類似，蜂花粉對回腸絨毛保護(hù)作用強(qiáng)于對隱窩的保護(hù)。

圖5 蜂花粉對小鼠回腸絨毛的影響Fig.5 Effect of bee pollen on ileal villi in mice

3 結(jié)論與討論

3.1 地塞米松對小腸組織結(jié)構(gòu)有不良影響

地塞米松屬于糖皮質(zhì)激素，制備免疫抑制模型的常用藥物之一[9]。其大多數(shù)作用都是基于與特異性受體的相互作用的結(jié)果[10]，其受體廣泛存在于肝、胃腸平滑肌、淋巴組織、胸腺等細(xì)胞內(nèi)[11]，糖皮質(zhì)激素進(jìn)入靶細(xì)胞，與其受體結(jié)合后，形成激素-受體復(fù)合物作為基因轉(zhuǎn)錄的激活因子，合成或抑制某些特異性蛋白質(zhì)，由此易導(dǎo)致腸道功能紊亂[12]，而且大劑量的糖皮質(zhì)激素會誘導(dǎo)胃產(chǎn)生較多的胃蛋白酶和胃酸, 損傷胃黏膜屏障，加快消化性潰瘍進(jìn)展[13]。李相玲等[14]在探討“環(huán)磷酰胺和地塞米松對小鼠腸道黏膜免疫抑制的比較”研究中證明DEX主要通過抑制胸腺依賴性淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致輔助性T細(xì)胞輔助B細(xì)胞的活化能力下降，抑制腸道淋巴細(xì)胞活化，抑制腸道粘膜免疫；潘書磊等[15]在探討“地塞米松對仔豬腸道黏膜形態(tài)的影響”中證明DEX會影響腸道絨毛發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

3.2 蜂花粉對地塞米松致小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)損傷后與功能有改善和保護(hù)作用

蜂花粉營養(yǎng)成分豐富，具有多種生理功能, 如調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗炎、抗腫瘤、抗凋亡、增強(qiáng)應(yīng)激能力、降低膽固醇等作用[16]；蜂花粉因富含有酚酸和黃酮類物質(zhì)具有抗氧化能力[17]，其中的類黃酮可以治療過敏性和免疫性疾病[18]；蜂花粉具有很好的抗菌活性，對細(xì)菌、真菌的生長都有一定的抑制作用[19]。有研究表明蜂花粉可以明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，抵御細(xì)菌和某些病毒，對機(jī)體無毒副作用, 作為免疫增強(qiáng)劑十分理想[20]。王允超等[21]研究發(fā)現(xiàn)，破壁蜂花粉能調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進(jìn)乳酸菌等有益菌生長，降低腸道pH，改善腸道內(nèi)環(huán)境。

小腸是動物機(jī)體食物消化和選擇性吸收的主要場所，其分為十二指腸段、空腸段與回腸段，而十二指腸段杯狀細(xì)胞少，絨毛密集，其中的G細(xì)胞可分泌胃泌素，促進(jìn)胃酸的分泌，S細(xì)胞分泌的促胰酶素可促進(jìn)胰液分泌，是消化吸收功能最強(qiáng)的。同時腸道在機(jī)體免疫中扮演著重要的角色[22]，淋巴組織廣泛的分布，形成黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosal-associated lymphoid tissue, MALT)，比如腸道孤立淋巴小結(jié)，彌散淋巴組織等[23]，抵御外來病菌和異物的侵襲。測定的小腸組織結(jié)構(gòu)各項指標(biāo)包括絨毛高度、隱窩深度及其兩者的比值，此為探究模型建立后腸道受損與對照組的差異性，從而探究蜂花粉的適宜功效濃度。研究證明腸道的絨毛高度和隱窩深度可以體現(xiàn)腸道的功能狀態(tài)，絨毛高度增加，其相應(yīng)的吸收表面積也增大，吸收能力加強(qiáng)[24]，對提高動物生產(chǎn)性能具有重要意義。

本次實驗證明通過地塞米松磷酸鈉注射液建立的腸道損傷模型與對照組相比，小鼠的絨毛高度、隱窩深度差異均顯著(P<0.05)，依據(jù)前人研究選擇0.357 mg/mL、0.714 mg/mL、1.071 mg/mL、1.429 mg/mL蜂花粉濃度，發(fā)現(xiàn)其對腸道損傷小鼠的絨毛高度、隱窩深度均有顯著的保護(hù)作用(P<0.05)，而在以上濃度中1.071 mg/mL組對小鼠腸道的形態(tài)恢復(fù)效果最好。

綜上所述，腹腔注射地塞米松對小鼠小腸的組織結(jié)構(gòu)具有明顯不良影響，甚至造成損傷；飲水添加不同濃度蜂花粉對地塞米松致小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)損傷有明顯的緩解和保護(hù)作用，其中以添加1.071 mg/mL蜂花粉濃度組對模型小鼠小腸作用最佳。