郭偉娜，胡明靜，趙 霞，路振香，顧有方

(安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)是健康動物上呼吸道的一種正常寄生性細菌[1]，但也是許多動物的潛在病原體，與多種動物的呼吸道綜合征有關(guān)。當動物機體受到多種應(yīng)激因素作用時，或者機體的免疫功能低下，主要引起豬萎縮性鼻炎、豬肺疫、禽霍亂和牛出血性敗血癥等多種病癥[2-3]。多殺性巴氏桿菌血清型較多，根據(jù)莢膜抗原的不同，可分為A、B、D、E和F共5個血清型，根據(jù)脂多糖結(jié)構(gòu)不同可分為16個血清型[4]。不同莢膜血清型的Pm可感染豬、禽、牛等多種動物，其中血清型A、B、D均可誘發(fā)豬的疾病，其中A和D血清型主要引起豬肺炎，而B血清型引起豬出血性敗血癥[5]；與禽類相關(guān)的主要是A血清型，而感染牛的主要是A和D血清型。

多殺性巴氏桿菌的致病性與多種毒力因子有關(guān)，主要包括皮膚壞死毒素、黏附素、鐵攝取蛋白、外膜蛋白、唾液酸酶等[6]。其中皮膚壞死毒素是由toxA基因編碼，與黏附素相關(guān)的編碼基因包括ptfA、fimA、flp1、flp2、hsf1和hsf2等，與鐵攝取蛋白有關(guān)的編碼基因有tonB、exbB、exbD、tbpA、hgbA、hgbB、Fur等，與外膜蛋白有關(guān)的編碼基因有ompA、ompH、oma87、plpB等，編碼唾液酸酶的基因主要為nanB和nanH。多殺性巴氏桿菌的致病性與病原菌的毒力、數(shù)量、侵入途徑以及機體的免疫力和環(huán)境因素等有關(guān)，而含有毒力因子不同對其致病性有重要作用。目前，我國的豬病發(fā)生多表現(xiàn)為混合感染，及時檢出隱性帶菌的動物，對豬場疾病的防控有重要意義。因此，本研究主要是采集安徽鳳陽地區(qū)某豬場的鼻拭子進行Pm的分離，用PCR方法檢測分離菌株的23個毒力基因，從而為研究多殺性巴氏桿菌的致病性提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

莢膜血清A型豬源Pm(CVCC401，中國獸藥監(jiān)察所);實驗用清潔級昆明小鼠及墊料(合肥博源動物實驗有限公司);血瓊脂培養(yǎng)基(常德比克曼生物科技有限公司);PCR MasterMix,5×TAE緩沖液,DL-2000 DNA Marker等(南京邁克沃德生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 于2019年9月從安徽鳳陽某規(guī)模化養(yǎng)豬場無菌采集育肥豬的鼻拭子樣品30份。采集后的拭子樣品置于已滅菌的PBS中浸潤，做好標記，用冰袋保存快速送實驗室進行培養(yǎng)。

1.2.2 Pm的分離純化 將鼻拭子樣品分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后挑取符合Pm特征的單個菌落接種到血瓊脂培養(yǎng)基上進行純化，對純化后的單個細菌用美藍染色鏡檢。

1.2.3 模板的制備 挑取純化后的單個菌落溶于50 μL無菌超純水中，用煮沸法提取核酸作為模板，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 引物合成 參考相關(guān)文獻中Pm的16S rRNA引物序列[7]，以及其23個毒力基因的引物序列[8]，由安徽通用物有限公司合成引物，引物序列及目的片段大小見表1。

表1 引物序列及目的片段大小Table 1 The primer sequences and size of target fragments

1.2.5 16S rRNA的PCR擴增及測序 PCR反應(yīng)體系為50 μL：2 μL模板、25 μL的2× PCR MasterMix、10 μmol/L的上游引物和下游引物各2 μL、19 μL超純水。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否擴增出目的條帶，將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至安徽通用生物有限公司進行測序分析。

1.2.6 毒力基因的PCR檢測 PCR方法檢測分離菌株的23個毒力基因，其反應(yīng)體系同1.2.6節(jié)，退火溫度調(diào)整為51 ℃，其它反應(yīng)條件一致。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，并將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送測序分析。

1.2.7 小鼠致病性試驗 選用12只清潔級雌性昆明小鼠，分為實驗組和對照組2組，每組6只小鼠。用純化后的分離菌株復(fù)蘇培養(yǎng)至對數(shù)生長期，實驗組小鼠每只腹腔接種0.2 mL純培養(yǎng)物；對照組用0.2 mL生理鹽水進行腹腔注射。接種后每隔一段時間觀察并做好記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離及染色結(jié)果

從鼻拭子樣品中分離純化的菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上可觀察到圓形、光滑、濕潤、半透明的灰白色小菌落(圖1)，而在普通營養(yǎng)瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基上不生長，與多殺性巴氏桿菌的培養(yǎng)特點一致。該分離菌株用美藍染色鏡檢，可見典型的兩極濃染的短球桿菌(圖2)，符合多殺性巴氏桿菌的染色特征。由以上分離及染色結(jié)果初步判定該分離菌為多殺性巴氏桿菌，但仍需結(jié)合后續(xù)分子鑒定結(jié)果。

圖1 分離菌在血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology the isolated bacteria on blood agar medium

圖2 分離菌的美藍染色鏡檢結(jié)果(×1 000)Fig.2 Methylene blue staining microscopy results of the isolated bacteria

2.2 16S rRNA的PCR擴增結(jié)果

16S rRNA的PCR擴增結(jié)果顯示Pm分離株檢測出425 bp的目的條帶，與Pm標準菌株一致(圖3)。PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果表明，分離菌與多殺性巴氏桿菌菌株VP161(Genbank登錄號：CP048792)的同源性為99.52%。

圖3 16S rRNA的PCR擴增結(jié)果Fig.3 The results of PCR amplification for 16S rRNA

2.3 毒力基因的PCR檢測結(jié)果

分離菌的23個毒力基因的PCR擴增結(jié)果中，除了toxA、hgbB、nanB、hsf1、tbpA等5個基因未擴增出目的條帶，其余的18個毒力基因均檢測出目的條帶 (圖4～5)，PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果表明，其與Pm相應(yīng)毒力基因的同源性位于98.82%～100%之間，具體見表2。

圖4 毒力基因的PCR擴增結(jié)果Fig.4 The results of PCR amplification for virulent genes注：1～12分別是ptfA、fimA、pfhA 、tadD、toxA、sodA、sodc、ompA0、ompH、oma87、plpB、exbB基因。

圖5 毒力基因的PCR擴增結(jié)果Fig.5 The results of PCR amplification for virulent genes注：13～23分別為exbD、tonB、hgbA、hgbB、Fur、nanB、nanH、hsf1、hsf2、tbpA、pmHAS基因。

表2 毒力基因同源性比對結(jié)果Table 2 The identity comparison of virulence genes

2.4 小鼠致病性試驗結(jié)果

接種后發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠有精神萎靡、食欲不振等癥狀，于接種后的18 h內(nèi)全部死亡，而對照組小鼠表現(xiàn)正常。剖檢病死鼠發(fā)現(xiàn)，其心臟、肝臟和肺臟均有出血，從病變組織中再次分離到Pm菌株，并且其菌落特征和染色結(jié)果均與原分離株相符，后經(jīng)16S rRNA的PCR擴增及序列測定，證實與原分離株相同。

3 結(jié)論與討論

黏附素是病原菌一種潛在的毒力因子[9]。研究發(fā)現(xiàn)，fimA、pfhA和ptfA等黏附相關(guān)基因在Pm中的攜帶率較高[10-11]，本研究也檢測出fimA、pfhA和ptfA這3個毒力基因，其序列與Pm相應(yīng)毒力基因的同源性分別為99.64%、99.30%和99.79%。Pm所含的鐵攝取相關(guān)蛋白和外膜蛋白等在病原菌感染過程中同樣發(fā)揮重要作用[12]。從中國、巴西和越南分離的豬源Pm菌株中鐵攝取蛋白相關(guān)基因exbB和exbD均有較高的攜帶率[10,13-14]，本研究也檢測出這2個毒力基因，其序列與Pm對應(yīng)基因的同源性分別為99.65%和99.60%。Khac等[14]研究發(fā)現(xiàn)，81個豬源Pm菌株中外膜蛋白基因ompA、ompH和oma87的檢出率分別為56.62%、68.67%和100%，本研究共檢測出ompA、ompH、oma87和plpB等4個外膜蛋白基因，其序列與Pm對應(yīng)基因的同源性分別為99.50%、99.32%、99.15%和98.97%。tbpA基因編碼一種轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白A，是與鐵攝取相關(guān)的一種受體，有研究表明，該受體主要存在于牛、羊等動物源Pm[15]。本研究未檢測出tbpA基因，分析可能是該基因不存在于豬源Pm中。toxA基因編碼的皮膚壞死毒素可引起鼻甲骨的溶骨作用，是豬傳染性萎縮性鼻炎的主要致病因子[16]，多數(shù)研究表明[6,10,13]，主要是D血清型的Pm含有toxA基因，而A血清型不含有該基因。本試驗中的Pm菌株沒有檢測出toxA基因，經(jīng)后期鑒定為A血清型，與以上結(jié)果一致。

本研究從安徽鳳陽某豬場采集的鼻拭子中分離到1株P(guān)m，并檢測出18個毒力基因，同時致病性試驗表明該分離菌株對小鼠有致死性，這對該豬場的疾病防控提出了預(yù)警，也為豬源多殺性巴氏桿菌的致病性研究提供一定參考。本試驗中樣品采集的時間在2019年9月份，外界氣溫較高，樣品采集、保存和運輸過程等都會受到一定影響。另外，豬場環(huán)境因素對Pm的檢出也有一定促進作用，如豬舍的溫度、濕度、通風條件、衛(wèi)生消毒等飼養(yǎng)管理措施不嚴格都會引發(fā)疾病。由此可知，豬場的環(huán)境衛(wèi)生條件及管理對豬病特別是一些條件致病菌的防控及其關(guān)鍵，每個豬場均需制定嚴格的飼養(yǎng)管理制度和衛(wèi)生消毒措施，減少應(yīng)激因素才能較好地控制疾病的發(fā)生。