曲 杰，郭 靜，褚會松，呂喜英＊＊

（1. 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 承德 067000；2. 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 承德 067000）

鳳尾草又被稱為井口草、鳳凰草、山雞尾、雙鳳尾等，屬鳳尾蕨科植物，因其經(jīng)常在潮濕的地方生長而得名，如石隙、井邊和墻根等處[1]。鳳尾草生長區(qū)域較為廣泛，全國大部分地區(qū)均可采集到，主要集中在兩廣地區(qū)、福建、江蘇、貴州等地區(qū)，一年四季均能采集。鳳尾草是一種功效豐富，歷史悠久的中草藥，最早在唐朝《本草拾遺》中有記載，后于明代《中草藥性備要》中也曾描述其止血消毒的作用。不同的歷史時期均有書籍對鳳尾草的療效進(jìn)行了記載，如《植物名實圖考》《分類草藥性》《本草推陳》和《廣西本草選編》等。直至新中國初期，鳳尾草在我國民間開始逐漸被廣泛使用。

隨著對鳳尾草的化學(xué)成分和治療效果的不斷研究，鳳尾草在臨床上的應(yīng)用也較為常見，在抗炎消腫、抑制細(xì)胞氧化、影響體內(nèi)某些激素表達(dá)等方面均能發(fā)揮作用，甚至能起到抗腫瘤作用，另外其排毒消炎、散熱止血之功效不容小覷[2]。因此，鳳尾草治療較為廣泛，不但對呼吸消化泌尿系統(tǒng)、婦科炎癥、皮膚病、癌癥、出血癥等疾病起到顯著療效，而且在多種疑難雜癥的治療方面也能起到作用，如小兒驚風(fēng)夜哭、跌打燙傷、貓狗咬傷、農(nóng)藥中毒、眼花牙痛、神經(jīng)麻痹等[3]。

目前，國內(nèi)外對鳳尾草的臨床研究也逐步發(fā)展起來，秦波等[4]研究了鳳尾草中的組成物質(zhì)，從全草中分離出22 種化合物，包括黃酮類、萜類化合物、氨基酸、脂肪酸、揮發(fā)油等，其中含量最高的為黃酮類[5]。黃酮類是自然界較為常見的一種有機(jī)化合物，廣泛存在于植物中，且具有多種生物活性，因此在國內(nèi)外引起重視，得到廣泛研究。黃酮類化合物具有以下幾點(diǎn)特性：第一，黃酮類化合物的典型特征為能夠清除自由基，對感染性疾病、炎癥反應(yīng)、燒傷燙傷及電離輻射等疾病起到治療作用[6]。第二，黃酮類化合物對人體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)起到影響作用，催化電子轉(zhuǎn)移，能作為保護(hù)機(jī)體的重要還原劑[7]。第三，黃酮類化合物能夠?qū)Χ喾N生物酶具有抑制作用，如氧化還原酶、磷酸酯酶、蛋白酶、水解酶等[8]。第四，黃酮類化合物能夠影響機(jī)體內(nèi)激素水平的表達(dá)[9]，影響感官表達(dá)，協(xié)調(diào)神經(jīng)運(yùn)動，減輕痛覺神經(jīng)等[10]。第五，黃酮類化合物能通過與重金屬離子結(jié)合起到解毒作用[11]，對心血管疾病、過敏反應(yīng)、呼吸系統(tǒng)疾病、癌癥、胃腸道潰瘍等多種疾病均能起到顯著臨床療效[12]。據(jù)相關(guān)研究結(jié)果報道，鳳尾草和其他中草藥結(jié)合可以有效治療多種癌癥，如消化道和婦科等腫瘤[13]。雖然鳳尾草的應(yīng)用廣泛，但是關(guān)于其對細(xì)胞遷移作用方面的研究很少，因此本研究主要研究了鳳尾草總黃酮（TFPM）濃度水平對肺癌A549 細(xì)胞體外遷移能力的影響，并探討其發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞株

細(xì)胞株從承德醫(yī)學(xué)院實驗室獲取人肺癌A549 細(xì)胞株。

1.1.2 藥物的制備

藥物的制備：承德醫(yī)學(xué)院提供鳳尾草樣品，并將其保存于干燥容器中備用。

1.1.3 主要試劑與主要儀器

主要試劑：胎牛血清（Gibco 產(chǎn)品）、RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco產(chǎn)品），濃度為0.25%的胰蛋白酶（Gibco產(chǎn)品），F(xiàn)GF4 抗體（Sigma 產(chǎn)品），辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（博奧森公司產(chǎn)品）。

主要儀器：DF-20M 離心機(jī)（湖南湘儀產(chǎn)品），CO2培養(yǎng)箱（美國NUAIRE 公司），顯微鏡（德國Leica 公司），生物安全柜（上海力康），培養(yǎng)皿（美國Corning 公司），高壓消毒鍋（日本雅馬拓公司產(chǎn)品），分光光度計（HP Agilent），EL104電子天平（梅特勒-托利儀器上海有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在溫度37℃、CO2濃度5%的條件下，將A549 細(xì)胞置于RPMI-1640 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并以胰酶消化，通過顯微鏡觀察細(xì)胞生長并提取對數(shù)生長期A549 細(xì)胞株。

1.2.2 制備TFPM溶液

提取儲存良好的鳳尾草干燥全草200 g 并進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)備濃度為70%的乙醇溶液，將二者分別以1:20的比例進(jìn)行配伍，在60℃的條件下提取2 h，共提取2次[14-15]。將2 次的提取液融合、凍干后得5.0 g 干燥固體。取磷酸鹽緩沖溶液（PBS 溶液）500 mL 將其溶解于所得固體中，利用高速離心機(jī)以15000 r/min 分離15 min，共進(jìn)行 3 次。將離心后的上清液用 0.22 μm 過濾器過濾，滅菌，并置于冰箱中，溫度設(shè)定為4℃進(jìn)行保存。最終獲得溶液采用蘆丁作為對照品并以NaNO2-A1(NO)3-NaOH 顯色，紫外分光光度法在510 mm 處測得總黃酮含量[16]。以蘆丁的形式制備總黃酮含量為10 mg/mL的溶液。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

備好的6孔培養(yǎng)板中每孔各接種1 mL 的A549 細(xì)胞懸液，并分別在其中加入濃度為10 mg/ mL、5 mg/mL、2.5 mg/ mL、1.25 mg/ mL 的 TFPM 和不含 TFPM的PBS 溶液各100 μL 進(jìn)行培養(yǎng)，各組進(jìn)行對照。每24 h觀察每孔中腫瘤細(xì)胞形態(tài)并詳細(xì)記錄。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實驗

在6 孔培養(yǎng)板上鋪展后，A549 細(xì)胞系逐漸生長，在覆蓋劃痕后，用PBS 溶液洗滌并在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別在0 h 和24 h 對劃痕距離進(jìn)行測量并記錄。

1.2.5 Transwell 實驗

取對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞中加入胰酶，RPMI-1640 培養(yǎng)基制備約5×105/mL 個細(xì)胞的懸液并進(jìn)行鋪板。RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（含15%的小牛血清）置于24 孔培養(yǎng)板中，每孔各 600 μL。將 100 μL 的 A549細(xì)胞懸液和10 μL 1%的 BSA 溶液置于Transwell 的上室中，最終以濃度為0.1%的BSA 溶液維持上室內(nèi)滲透壓。各上室中分別加入100 μL 不同濃度的TFPM 和 PBS 溶液，各下室中各分別加入 600 μL 的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，濃度為5%，溫度為37℃，時間為24 h。最后，將培養(yǎng)基用90%乙醇固定，消毒棉擦拭上室面和0.1%結(jié)晶紫溶液漂染下室面，風(fēng)干處理好樣本后顯微鏡觀察并記錄。選取4 個視野（×400）內(nèi)的細(xì)胞算平均值（共進(jìn)行3 次）。

1.2.6 Westen blot實驗

提取細(xì)胞數(shù)約為5×106個的A549 細(xì)胞原液和加入TFPM 后的A549 細(xì)胞，并在其中分別加入細(xì)胞裂解液300 μL。半小時后，將其轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，并在4℃下以12000 r/min 離心。將離心4 min 后的上清液置于-20℃溫度保存。采用BCA 法測定其中蛋白濃度。上樣量蛋白含量為40 ng 并進(jìn)行電泳（80 V 下30 min，120 V 下 90 min）。在 PVDF 膜上用 PBST 溶液（含有5%脫脂奶粉）密封，經(jīng)過2 h 后加入FGF4 抗體（1：500）和抗β-actin 抗體（1：500），溫度保持在4℃的條件下過夜。PBST 液洗15 min 取膜后蛋白，洗過3 遍后，室溫下二抗（1：3000）封閉。1 h 后PBST 液再洗10 min，洗過3 遍后取出。用X-光片記錄化學(xué)發(fā)光法檢測的所得溶液。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

實驗結(jié)果分為兩組，實驗組為TFPM 處理（以5 mg/mL 和 10 mg/mL 為例）后的細(xì)胞，對照組為 PBS 處理后的細(xì)胞。以下結(jié)果均以此兩濃度藥物處理組為例，實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果較為一致。結(jié)果顯示，分別在0 h 和24 h 觀察腫瘤細(xì)胞生長，對照組A549 細(xì)胞生長較為均勻，貼壁現(xiàn)象明顯，且細(xì)胞規(guī)則清晰、形態(tài)飽滿；實驗組A549 細(xì)胞生長速度明顯減慢，細(xì)胞明顯壞死縮小，細(xì)胞生長貼壁不明顯，且此現(xiàn)象與TFPM 濃度有關(guān)，TFPM 濃度越高，此現(xiàn)象越明顯，兩者呈正相關(guān)關(guān)系，見圖1。

2.2 劃痕實驗

兩組細(xì)胞經(jīng)過劃痕后出現(xiàn)相同的無細(xì)胞區(qū)，經(jīng)24 h 后對照組無細(xì)胞區(qū)內(nèi)細(xì)胞覆蓋明顯，腫瘤細(xì)胞幾乎全部遷移至無細(xì)胞區(qū)；而實驗組無細(xì)胞區(qū)細(xì)胞覆蓋不明顯，仍有無腫瘤細(xì)胞遷移區(qū)，且5 mg/mL組細(xì)胞遷移比 10 mg/mL 組更明顯（P＜0.05），見圖2。

2.3 Transwell 實驗

對照組和5 mg/mL、10 mg/mL TFPM組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(36.91±4.47)、(18.05±2.04)、(6.35±2.32)，兩組差異顯著（P＜0.01）。TFPM 的濃度顯著影響跨膜細(xì)胞的數(shù)量，5 mg/mL 組較10 mg/mL 組穿膜細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.01），兩者之間存在負(fù)相關(guān)，見圖3。

2.4 Westen blot實驗

實驗組FGF4 蛋白水平與對照組相比明顯減少（P＜0.05），且TFPM 濃度為10 mg/mL 組較5 mg/mL 組減少更明顯（P＜0.05），見圖 4。

圖1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

圖2 劃痕實驗細(xì)胞遷移情況

圖3 Transwell實驗，HE染色×400倍

圖 4 Westen blot 實驗

3 討論

作為常見的腫瘤，肺癌目前已成為癌癥致死的首要病因[17]。根據(jù)美國國家癌癥中心2018 年發(fā)布的最新數(shù)據(jù)[18]，男性肺癌發(fā)病率及死亡率均居首位，女性發(fā)病率僅次于乳腺癌，位居第二位，但死亡率仍為第一位，發(fā)病率和死亡率分別達(dá)到57.13/10 萬人和45.80/10萬人，成為人類生命健康的頭號“殺手”。肺癌的可怕之處不僅在于持續(xù)升高的發(fā)病率和死亡率，而且因其惡性程度較高，患者生活質(zhì)量和預(yù)后大大降低。相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示，早期可手術(shù)患者手術(shù)治療后5 年生存率為60%左右，而存在轉(zhuǎn)移的晚期患者5 年生存率明顯下降，局部轉(zhuǎn)移為27%左右，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移僅為5%左右。由于肺癌患者臨床癥狀并不明顯，故約三分之二的患者發(fā)現(xiàn)較晚，因此總的5 年生存率大約為15%左右[19]。根據(jù)病理類型不同，肺癌可分為兩種類型：小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC 又可大致分為肺鱗癌（squamous lung cancer）和非鱗非小細(xì)胞肺癌（non-squamous non-small cell lung cancer，non-sq NSCLC）。其中SCLC 約20%，屬未分化癌，因此具有較強(qiáng)的侵襲性，且轉(zhuǎn)移率較高，僅部分早期患者可手術(shù)。其余80%為NSCLC，因病理類型和分期不同，治療方法也不同，對于晚期患者主要采取多學(xué)科的綜合治療，但臨床療效并不理想[20]。近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)的不斷研究發(fā)展，晚期肺癌尤其是non-sq NSCLC，在分子靶向治療和免疫治療方面取得了重大進(jìn)展，為臨床治療提供更多選擇，延長患者無進(jìn)展生存 期（progression-free survival，PFS）和 總 生 存 期（overall survival，OS），提高患者生活質(zhì)量（quality of life，QoL），但總體來說，NSCLC 患者比SCLC 患者預(yù)后相對較好，生存期更長[19,21]。

肺癌患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移將嚴(yán)重降低患者的存活時間和存活質(zhì)量。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的一種常見生物學(xué)現(xiàn)象，其發(fā)生過程較為復(fù)雜，受許多基因的調(diào)控[22]。經(jīng)國內(nèi)外學(xué)者多年研究表明，肺癌出現(xiàn)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象可能與患者體內(nèi)多種細(xì)胞因子表達(dá)異常關(guān)系密切[23]。細(xì)胞因子上有許多能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及其相互作用的多肽分子，這些多肽分子能產(chǎn)生多種不同類型、不同功能的細(xì)胞[24]。值得注意的是，腫瘤細(xì)胞也能大量產(chǎn)生部分這類細(xì)胞因子，使得腫瘤細(xì)胞具有多種調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞，如促使肺癌腫瘤細(xì)胞遷移的因子成為國內(nèi)外專家學(xué)者研究的重點(diǎn)，本實驗中主要針對成纖維生長因子4（FGF4）進(jìn)行研究。成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）存在于多種腫瘤細(xì)胞膜上，其基因編碼多種蛋白，是一個多基因家族[25]，在多種腫瘤細(xì)胞表面均可見到其表達(dá)，這表明FGF 可能與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)[26]。FGF4 細(xì)胞是其中的一種由多種細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白，F(xiàn)olkman 等[27-28]相關(guān)研究結(jié)果認(rèn)為，F(xiàn)GF4 不但能參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管形成和瘢痕愈合，還能通過作用于細(xì)胞的接觸抑制、游離、變形、穿膜、附著等多個過程從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖分化和離散遷移[29]。

目前，臨床上應(yīng)用的抗腫瘤藥物多為生物制劑或者化學(xué)合成的產(chǎn)物，存在較大的毒副作用，且往往達(dá)不到預(yù)期的臨床療效。我國作為許多天然藥物的盛產(chǎn)地，中草藥治療癌癥已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。

迄今為止，有許多關(guān)于中藥抗腫瘤的相關(guān)報道，其中包括中草藥的特有成分對腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞因子影響的報道[30]。在對肺癌治療有效的中草藥中，鳳尾草中總黃酮含量對抗腫瘤作用和對細(xì)胞因子的影響進(jìn)行深入研究?！侗静菔斑z》中記載，鳳尾草具有排毒殺菌、祛熱鎮(zhèn)痛及抗腫瘤作用，目前應(yīng)用于多種疾病的治療。雖然鳳尾草中含有多種化學(xué)成分，但提純后TFPM 為最主要成分，其具有多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，TFPM 的作用主要有三方面：第一，抗菌作用：鳳尾草中的黃酮類化合物對多種細(xì)菌均有很強(qiáng)的抑制作用，如金葡菌、枯草桿菌、黑曲霉菌等，而對大腸桿菌、青霉菌的抑制作用較弱，對黃曲霉菌則沒有見到抑制作用[31]。第二，抗腫瘤作用：顏大海等[32]對鳳尾草的實驗研究結(jié)果顯示，鳳尾草能激活纖溶系統(tǒng)，阻止血小板的聚集，抑制新生毛細(xì)血管，進(jìn)而降低腫瘤所致的高凝狀態(tài)，抑制腫瘤細(xì)胞的粘附遷移能力。王剛等[33]利用小鼠作為動物實驗，將腫瘤細(xì)胞注射至小鼠體內(nèi)，測定鳳尾草中的提取物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用及小鼠脾細(xì)胞的增殖作用。實驗結(jié)果為鳳尾草提取物能顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖，且此現(xiàn)象呈劑量依賴性。第三，保肝作用：劉建群等[34]實驗結(jié)果顯示鳳尾草提取物可有效降低肝損傷的小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶水平。

目前，對于黃酮類化合物的臨床研究報道也較為常見。黃酮類化合物作為大自然中的天然產(chǎn)物，在食物中得到廣泛應(yīng)用，不但能作為多功能食品添加劑，如甜味劑、色素、抗氧化劑等，還能作為生物食品應(yīng)用，起到防氧化抗衰老、抗癌、降脂降壓等功效。除在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，黃酮類化合物在醫(yī)療和農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用也很常見，如各種特效藥和殺蟲劑等。雖然生物黃銅具有多種功效，但人體內(nèi)卻不能正常合成，且體外攝取的生物類黃酮在機(jī)體內(nèi)代謝較快，不能長期儲存。生物類黃酮在植物中較常見，人體主要通過各種飲品攝取，如咖啡、飲料、茶、酒水等，但雖然攝取途徑很多，但攝取量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到獲益水平。近年來對生物黃酮類的研究得到越來越多的重視，應(yīng)用也越來越廣，但機(jī)體如何消化吸收、在體內(nèi)的代謝過程等機(jī)理仍未全面認(rèn)識，且其在抗腫瘤作用及其作用機(jī)制方面的研究并不多見。故本研究將肺癌A549 細(xì)胞作為實驗對象，初步研究TFPM 與腫瘤細(xì)胞生長繁殖及細(xì)胞因子FGF4 蛋白表達(dá)水平之間的相互關(guān)系，了解其抑制細(xì)胞遷移發(fā)生的可能相關(guān)機(jī)制。

實驗結(jié)果顯示，TFPM 阻止肺癌A549 細(xì)胞遷移作用明顯，腫瘤細(xì)胞內(nèi)FGF4 蛋白水平隨之減少，且隨著TFPM 濃度的增加，這種現(xiàn)象越明顯。相關(guān)研究顯示，肺癌轉(zhuǎn)移可能與細(xì)胞內(nèi)FGF4 蛋白表達(dá)水平上升有關(guān)[35]，因此，A549 細(xì)胞中 FGF4 蛋白減少可能是 TFPM抑制肺癌細(xì)胞遷移的作用機(jī)制，但該結(jié)論還有待進(jìn)一步研究論證。