汪順貴，玉 倩，李華霞，李 歡，盧 玲，廖現(xiàn)秋，周艷英，宋 曦，秦紅玲，刁麗梅＊＊

（1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院 南寧 530023；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 南寧 530001）

癲癇（Epilepsy，Ep）是以大腦神經(jīng)元異常放電為特征的慢性反復(fù)發(fā)作性短暫性腦功能失調(diào)綜合征[1]。目前，全球約有6800 萬人受癲癇困擾[2]，每年每10 萬人中有67.77 人新增確診[3]。癲癇的發(fā)病機(jī)制仍不明確，臨床藥物治療效果欠佳，因此尋求有效的治療手段已刻不容緩。有研究表明，微小RNA（MicroRNAs；miRNA）與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)[4]，其可以通過調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元自噬和凋亡，影響癲癇的發(fā)病[5-6]。因此，在治療EP 過程中，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和凋亡或許可成為更為有效的新的治療方法。臨床及實驗探究發(fā)現(xiàn)，中西醫(yī)聯(lián)合治療癲癇，可以調(diào)高藥物的療效，改善EP 患者的預(yù)后及藥物的副反應(yīng)[7]。加味柴胡疏肝湯（Jiawei Chaihu Shugan Tang，JWCHSGT）具有疏肝解郁、化痰熄風(fēng)的功效，結(jié)合前人研究，本課題組前期研究觀察發(fā)現(xiàn)，JWCHSGT 可以降低癲癇發(fā)作頻率[8-10]，，預(yù)測出其靶基因自噬相關(guān)基因7（autophagy related gene 7，ATG7）。本實驗通過研究JWCHSGT 干預(yù)Ep 小鼠后，觀察其自噬相關(guān)基因ATG7、LC3Ⅱ、miR-204 的變化及神經(jīng)元凋亡情況。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性昆明小鼠70只，其中10只備用，SPF級，6～8周齡，體重25～30 g，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供（許可證：SYXK桂2009-0001）。

1.1.2 主要藥物與試劑

加味柴胡疏肝湯：柴胡15 g、白芍15 g、枳殼（麩炒）10 g、炙甘草6 g、川芎10 g、香附10 g、陳皮（醋炒）9 g、浙貝母15 g、生牡蠣30 g、鉤藤10 g、蜈蚣3條。所有藥材經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)羅耽副教授鑒定為正品，符合2015 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)范，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一采購備用（每單味藥要求同一產(chǎn)地、同一質(zhì)量層次、同一批次），采用自動煎藥機(jī)煎煮，濃縮至藥物濃度500 mg/mL；鹽酸匹羅卡品（美國Sigma 公司）、硫酸阿托品注射液（鄭州鈴銳制藥有限公司）、0.9%氯化鈉注射液（北京雙鶴藥業(yè)有限公司）、卡馬西平片（杭州賽諾菲制藥有限公司）制作成混懸液、蘇木素染色液、返藍(lán)液、分化液、DAB 顯色液、mmu-mir-204 antagomir、mmu-mir-204 agomir、Trizol、miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit、miRcute miRNA Detection Kit、miRcute miRNA isolation kit、TIANScript RT KIT、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）、TUNEL試劑盒等。

1.1.3 主要實驗儀器

熒光定量PCR 儀 ABI7500 、生物分光光度計BioPhotometer 、渦旋振蕩儀QL-902、光學(xué)顯微鏡BX43、離心機(jī)Centrifuge 5415D、攤烤片機(jī)KD-T、桌面數(shù)顯腦立體定位儀、超薄切片機(jī)：EM UC7等。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立與分組

本實驗的所有小鼠自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表的法將小鼠隨機(jī)分為6 組：A:生理鹽水組、B:模型組、C:加味柴胡疏肝湯組、D:加味柴胡疏肝湯＋miRNA-204 mimic 組、E：加味柴胡疏肝湯＋miRNA-204 inhibitor 組、F:卡馬西平組，每組各 10 只。除對照組外，其余組致癇步驟：先腹腔注射硫酸阿托品17 mg·kg-1，30 min 后腹腔注射鹽酸匹羅卡品180 mg·kg-1，給藥完畢后，按照經(jīng)典的 Racine（1972）的實驗動物癇性發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)對動物行為學(xué)觀察[11]。注射30 min后，對未出現(xiàn)4級以上發(fā)作的動物每隔15 min給予首劑1/3劑量的匹羅卡品追加注射，追加注射2次以后未出現(xiàn)4級以上發(fā)作的小鼠，視為造模失敗，不納入下一步行為學(xué)觀察。持續(xù)癇性發(fā)作達(dá)到1 h 后給予地西泮腹腔注射，以終止癇性發(fā)作。實驗小鼠給藥用量及方法參照《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)》中的標(biāo)準(zhǔn)方程進(jìn)行計算。灌胃液濃度及等效劑量均參照賀式計量-體表面D2=DIXr2/RI進(jìn)行合理折算。作如下處理：生理鹽水組即對照組：生理鹽水20 mL·kg-1·d-1灌胃，灌胃2周；模型組：不予加味柴胡疏肝湯灌胃；加味柴胡疏肝湯組：給予加味柴胡疏肝湯 7 g·kg-1·d-1灌胃 2 周；加味柴胡疏肝湯＋miRNA-204 mimic 組：灌胃中藥湯2 周后，在麻醉下通過腦立體定位儀，顱內(nèi)海馬區(qū)注射miRNA-204 mimic 2 μL；加味柴胡疏肝湯＋miRNA-204 inhibitor 組：灌胃中藥湯2 周后，在麻醉下通過腦立體定位儀，顱內(nèi)海馬區(qū)注射miRNA-204 inhibitor 2 μL；卡馬西平組：給予卡馬西平混懸液30 mg·kg-1·d-12 周。兩周后再次使用鹽酸匹羅卡品180 mg·kg-1致癇，對照組采用生理鹽水代替匹羅卡品。最后取材。將小鼠用3.5%水合氯醛按照1 ml/100g 體重的劑量通過腹腔注射麻醉，進(jìn)行脫頸椎致死后，剪去頭部毛發(fā)和頭皮，剝開顱骨，鈍性分離大腦皮層暴露海馬組織，將海馬周圍的大腦組織分開，最后取下海馬保存于液氮中。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）檢測藥物干預(yù)后小鼠海馬miR-204 以及自噬基因ATG7、LC3Ⅱ的表達(dá)

取30 mg 海馬組織進(jìn)行液氮研磨后采用Trizol 法提取總RNA，使用超微量紫外分光光度計檢測其濃度和純度，RNA 純度 A260/A280保持在1.8 ～ 2.2，濃度保持在500～1 000 mg·L-1才可以進(jìn)行下一步實驗，提取的RNA置于-80℃冰箱中保存。采用Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實驗，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：①37 ℃60 min;②85 ℃ 5 s。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在 96 孔板中進(jìn)行,每個反應(yīng)做3個復(fù)孔，反應(yīng)體系為 20 μL：cDNA 2 μL,上下 游 引 物 各 0.8 μL, SYRB Green Mix 10 μL, ROX Reference Dye II 0.4 μL, 去離子水 6 μL。PCR 擴(kuò)增條件：①95 ℃,30 s;②95 ℃,5 s,③60 ℃,34 s,40個循環(huán)。采用 Quantity One 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果采用2-△△CT法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.3 原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測藥物干預(yù)后小鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況

切片機(jī)將小鼠海馬切片5 μm，烤片65 ℃4.5 h;用二甲苯脫蠟浸洗切片2 次，每次5 min；用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗 1 次，每次 3 min；用Proteinase K 工作液處理組織 20 min 在 37°C；PBS 漂洗3 次，每次 5 min；制備 TUNEL 反應(yīng)混合液，處理組用50 μL TdT+450 μL 熒光素標(biāo)記的 dUTP 液混勻；而陰性對照組僅加50 μL 熒光素標(biāo)記的dUTP 液。于組織上加50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液（陰性對照組僅加50μL熒光素標(biāo)記的dUTP液）于標(biāo)本上，在避光濕盒中反應(yīng)37 ℃× 1 h。PBS 漂洗3 次，每次5 min；玻片干后加50 μL converter-POD 于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37 ℃×30 min。PBS 漂洗 3 次；在組織處加 50～100 μl DAB 底物，反應(yīng) 15～25 ℃×10 min；PBS漂洗3次；拍照后再用蘇木素復(fù)染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。每張切片選取5 個高倍鏡（10×20）視野（共計200～500個細(xì)胞），觀察小鼠海馬C1區(qū)凋亡細(xì)胞并拍照，計算每100 個細(xì)胞內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)。計算TUNEL 性細(xì)胞百分率：

陽性細(xì)胞百分率＝陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 PCR引物序列

本研究采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析，所有數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。符合正態(tài)分布時，組內(nèi)前后差異比較采用配對樣本t 檢驗，組間差異比較采用獨立樣本t 檢驗；不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗，用中位數(shù)和四分位數(shù)間距（Md，（P25，P75））表示。P＞0.05 差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 為差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 加味柴胡疏肝湯對癲癇小鼠海馬miR-204 及自噬基因LC3Ⅱ、ATG7表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組miR-204 表達(dá)下調(diào)，LC3Ⅱ、ATG7 的表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，使用加味柴胡疏肝湯和加味柴胡疏肝湯+miR-204 抑制物后，miR-204 表達(dá)上調(diào)，LC3Ⅱ、ATG7 的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；卡馬西平組和加味柴胡疏肝湯+miR-204 模擬物組，miR-204 表達(dá)上調(diào)、LC3Ⅱ、ATG7 的表達(dá)下調(diào)更加顯著（P＜0.01）。詳見表2。

2.2 加味柴胡疏肝湯對癲癇小鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

TUNEL 陽性細(xì)胞為凋亡的海馬神經(jīng)元，光鏡下其陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色或棕褐色顆粒；正常非凋亡細(xì)胞，胞核被蘇木素染成藍(lán)色，其大小，形態(tài)相對一致。圖片生理鹽水組（A 組）海馬C1 區(qū)可見個別陽性細(xì)胞，模型組（B 組）海馬C1 區(qū)可見大量陽性細(xì)胞，加味柴胡疏肝湯組（C 組）其陽性細(xì)胞較模型組明顯減少，加味柴胡疏肝湯＋miRNA-204 mimic 組（D組）陽性細(xì)胞較單純使用柴胡疏肝湯減少，加味柴胡疏肝湯＋miRNA-204 inhibitor 組（E 組）陽性細(xì)胞介于C組和D組之間，卡馬西平組（F組）陽性細(xì)胞較生理鹽水組稍有增多，采用單因素方差統(tǒng)計分別對各組TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：不同組別的陽性細(xì)胞凋亡指數(shù)存在明顯差異（F=520.65，P＜0.01），進(jìn)一步進(jìn)行組間比較發(fā)現(xiàn)任意兩組神經(jīng)元凋亡指數(shù)均存在明顯差異（P＜0.01）。詳見圖1、表3。

表2 相關(guān)基因在不同組小鼠海馬中表達(dá)量(，n=10)

表2 相關(guān)基因在不同組小鼠海馬中表達(dá)量(，n=10)

注：與生理鹽水組相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義

miR204 1.01±0.07 0.17±0.03ΔΔ 0.31±0.03▲0.58±0.09▲▲0.29±0.03▲0.66±0.08▲▲組別生理鹽水組模型組疏肝湯組疏肝湯+miR204模擬物組疏肝湯+miR204抑制劑組卡馬西平組ATG7 0.96±0.07 8.78±0.27ΔΔ 3.84±0.85▲2.56±0.85▲5.96±0.63▲1.93±0.32▲▲LC3II 1.03±0.05 6.76±0.46ΔΔ 3.67±0.74▲1.88±0.41▲▲4.82±0.36▲1.59±0.09▲▲

3 討論

癲癇是人類第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重影響人類的健康，西藥具副作用大，易復(fù)發(fā)，療效不穩(wěn)點等確定，中醫(yī)利用辨證論治的方法運(yùn)用不同的方藥，對于癲癇患者的調(diào)養(yǎng)、服藥后副作用及遠(yuǎn)期預(yù)后要優(yōu)于西醫(yī)。癲癇，中醫(yī)稱之為“癇病”，《三因極一病證方論·癲癇敘論》認(rèn)為癇病的病機(jī)與肝的疏泄功能異常關(guān)系密切，其風(fēng)、痰、瘀產(chǎn)生均為肝氣失于疏泄、條達(dá)的病理變化，因而“從肝論治”是治療癇病的關(guān)鍵所在[9]。柴胡疏肝湯具有鎮(zhèn)肝、疏肝、解郁的功效，已有臨床研究發(fā)現(xiàn)，其用于治療癲癇具有滿意的療效[12-13]。實驗研究研究表明柴胡皂苷，具有抗驚厥和鎮(zhèn)靜作用，能夠減少癲癇患者和動物模型的抽搐、異常腦電、凝視等癥狀的發(fā)生[14-15]。而浙貝母可以下調(diào)難治性癲癇大鼠模型的耐藥蛋白表達(dá)，降低癲癇發(fā)作頻率[16]。有研究表明，自噬和凋亡作用的過程與中醫(yī)的陰陽和平衡理論相通，過度或者不足的自噬及凋亡均可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生[17-18]。

圖1 加味柴胡疏肝湯對癲癇小鼠海馬C1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL,×200）

表3 加味柴胡疏肝湯對癲癇小鼠海馬C1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響（，n=10）

表3 加味柴胡疏肝湯對癲癇小鼠海馬C1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響（，n=10）

注：各組兩兩比較P＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)

F值P值520.65＜0.01組別生理鹽水組模型組疏肝湯組疏肝湯+miR204模擬物組疏肝湯+miR204抑制劑組卡馬西平組細(xì)胞凋亡指數(shù)/%4.75±0.96 63.75±1.71 40.50±1.29 25.75±3.40 49.25±2.50 8.50±1.29

癲癇的發(fā)病機(jī)制尤為復(fù)雜，近年來發(fā)現(xiàn)癲癇所導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元損傷與細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）有密切關(guān)系[19-20]。PCD 包括凋亡、自噬、程序性壞死、焦亡、鐵死亡等，其中細(xì)胞凋亡稱之為I 型細(xì)胞程序性死亡，細(xì)胞自噬稱之為II 型細(xì)胞程序性死亡[21]，這兩種是主要的細(xì)胞程序性死亡。正常生理性凋亡和自噬對于機(jī)體是有利的，而過度的細(xì)胞程序性死亡可以導(dǎo)致海馬神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細(xì)胞增生、突觸結(jié)構(gòu)或傳遞異常、炎性反應(yīng)、血管再生、離子通道的改變等，促使大腦異常放電，誘發(fā)癲癇[22-23]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，影響相關(guān)自噬、凋亡信號通路，如mTOR、Wnt/βcatenin 等通路參與癲癇的發(fā)生[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞在缺血缺氧條件下，可以使miRNA-204 表達(dá)降低，從而增加LC3-Ⅱ的表達(dá)水平，使心肌細(xì)胞過度自噬，加重心肌的壞死[26]。miR-204 還可以通過保護(hù)海馬神經(jīng)元，抑制癲癇樣放電[27]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，癲癇小鼠海馬神經(jīng)元凋亡較正常小鼠明顯增加，miRNA-204 下降，且相關(guān)自噬基因ATG7、LC3Ⅱ增多；而使用加味柴胡疏肝湯干預(yù)過后海馬神經(jīng)元凋亡明顯減少，miRNA-204 回升，自噬基因ATG7、LC3Ⅱ降低。同時，本課題組進(jìn)行了miRNA-204 的抑制及過表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，加味柴胡疏肝湯使miRNA-204 高，升高的 miRNA-204 可以抑制 ATG7、LC3Ⅱ的過度表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡率。綜上所述，加味柴胡疏肝湯可能減少神經(jīng)元的自噬與凋亡，治療癲癇。