胡 橋，余 功，饒 斌，謝 斌

（江西中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院 南昌 330004）

肺癌常有干咳少痰、痰中帶血、聲音嘶啞等燥熱傷肺表現(xiàn)，西醫(yī)放化療雖能明顯抑制肺癌細胞增殖，但其燥熱癥狀仍然存在，嚴重影響肺癌患者的生活質(zhì)量[1]。因此，抑制肺癌細胞增殖同時緩解燥熱是臨床治療肺癌急需解決的問題。中醫(yī)學認為，肺為嬌臟，喜潤惡燥，易受外界燥邪入侵致病，燥熱傷肺是肺癌的重要病機[2]。清燥救肺湯甘涼滋潤，清金保肺，實為清熱潤燥良方，凡病機屬燥熱傷肺、氣陰兩傷，臨床表現(xiàn)為一派津虧燥熱癥狀，均可遵照“燥者濡之”的原則應(yīng)用本方加減進行治療。故清燥救肺湯常用于肺癌臨床應(yīng)用，療效顯著，為諸多醫(yī)家所推崇[3-6]。

腫瘤細胞的增殖需要大量能量及合成原料，因此抑制細胞的能量生成，減少中間代謝產(chǎn)物合成，可有效抑制腫瘤細胞增殖。順烏頭酸酶（ACO1）及三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶(ACL)是三羧酸循環(huán)的兩個關(guān)鍵酶，抑制其表達可降低腫瘤細胞能量代謝速率，減少游離脂肪酸（FFA）及膽固醇（CHO）腫瘤細胞合成原材料，從而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用[7-8]。

本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)清燥救肺湯能顯著抑制荷Lewis 小鼠肺癌細胞增殖，抑制腫瘤細胞糖酵解關(guān)鍵限速酶活性，降低葡萄糖的攝取率，減少乳酸形成，從而導(dǎo)致進入三羧酸途徑的乳酸明顯減少。故本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，擬建立荷Lewis 肺癌小鼠模型，從三羧酸循環(huán)能量代謝角度進一步探索清燥救肺湯抗肺癌的機制，以期為臨床提供參考。

1 材料

1.1 藥物

清燥救肺湯組成：生石膏12 g，阿膠9 g，霜桑葉9 g，枇杷葉9 g，炙甘草3 g，麥冬10 g，黨參12 g，苦杏仁9 g，于北京同仁堂藥店購買。將中藥放入10 倍清水中浸泡0.5 h 后煎煮1 h，藥液沸騰后再改用文火繼續(xù)煎煮40 min，然后用三層紗布進行過濾，確保過濾干凈；留下的藥渣繼續(xù)加入8 倍量的清水進行第二次煎煮，同理煮沸后改用文火煎煮40 min，繼續(xù)用三層紗布過濾，將兩次濾液混合在一起，置于60℃恒溫烘箱內(nèi)烘干后用打粉機研磨成干粉27.62 g（1 g 含0.28 g 雜質(zhì)），故干粉實際有效成分質(zhì)量為27.62×0.72=19.9 g，得率19.9 g/73 g=27.26%。密封干粉，4 ℃保存?zhèn)溆?。藥量計算方法參考《中藥藥理研究方法學》[9]，小鼠用藥劑量=標準體質(zhì)量×人的劑量，將小鼠中劑量代替人臨床劑量。經(jīng)前期預(yù)實驗研究探索，本研究將清燥救肺湯高、中、低劑量分別定為11，5.5，2.75 g·kg-1·d-1。陽性藥物采用環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字16092525）進行腹腔注射，每次給藥劑量 25 mg·kg-1·d-1，隔日進行1次。

1.2 動物和瘤株

黑色雄性小鼠(SPF 級C57BL/6J) 50 只，單只質(zhì)量（20±2）g，于蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司購入，合格證號NO.201709571。小鼠Lewis 原代肺癌細胞（編號36470TM），從ATCC 細胞庫購入，批號JZLLSC:2017-0030。

1.3 試劑

RIPA 細胞裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號C1053）；十二烷基硫酸鈉（SDS）（西隴科學股份有限公司，批號151-21-3）；BCA 蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）（北京康為世紀生物科技有限公司，批號CW0014S)；封閉專用脫脂奶粉（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號P1622）；PCR mix(美國MCE 公司，批號HY-K0501)；CHO、FFA 酶鏈免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號分別為JL18914，JL11286）。

1.4 儀器

CO2-IR 型CO2細胞培養(yǎng)箱（上海丙林電子科技有限公司），Neofuge 13R型高速冷凍離心機（上海力申科學儀器有限公司），TC-100B 型恒溫搖床（上海領(lǐng)成生物科技有限公司），92-14860-00 型凝膠成像系統(tǒng)（美國 Alpha Innotech 公司），XW-80A 型 LongGeneRNA 逆轉(zhuǎn)錄儀（上海青浦滬西儀器廠），AFD9600 型熒光定量PCR儀（杭州安杰思有限公司）。

2 方法

2.1 Lewis細胞的培養(yǎng)及造模方法

將Lewis 細胞從液氮罐中拿出快速復(fù)蘇，然后在培養(yǎng)瓶中加入3 ml 10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放于含5% CO237 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好Lewis 細胞用生理鹽水將其密度調(diào) 至 5×106個/mL，再 以 0.2 mL/只 接 種 于 小 鼠 右腋下[10]。

2.2 分組及給藥

將小鼠隨機分為5 個小組，每組10 只，5 個小組分別是模型組，CTX 組，清燥救肺湯高、中、低劑量組。以接種后開始計算，24 h后，模型組用生理鹽水進行灌胃，0.2 mL/只，每 12 h 給藥 1 次；CTX 組用環(huán)磷酰胺進行腹腔注射，按50 mg·kg-1劑量給藥，隔日一次；清燥救肺湯高、中、低劑量組則在造模前2周即開始進行灌胃給藥，高、中、低劑量分別按照11，5.5，2.75 g·kg-1·d-1給藥，每12 h給藥1次，接種后繼續(xù)給藥2周。

2.3 實時熒光定量PCR檢測ACL mRNA表達水平

取冰凍腫瘤組織50 mg 于研缽中，往研缽里倒入適量的液氮用研錘進行充分研磨，然后往研缽中加入trizol 1 mL，靜置 5 min 后于 4 ℃，12 000 r·min-1離心 10 min，離心后取出靜置5 min，加入氯仿0.2 mL，劇烈震蕩30 s，靜置3 min，以4 ℃，12 000 r·min-1 第二次離心10 min；吸取上層水相至另一離心管中加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后以 4 ℃，12 000 r·min-1離心 10 min，棄上清，留沉淀；75%乙醇對沉淀進行洗滌；再以4 ℃，12 000 r·min-1離心 2 min，棄上清，留 RNA 沉淀；放置2～3 min，晾干后加入無酶水30～100 μL 溶解，充分溶解提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以cDNA為模板，以β-肌動蛋白(β-actin)基因為內(nèi)參，采用兩步法PCR 反應(yīng)程序，擴增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s；61 ℃退火10 s；72 ℃延伸1 min；共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后記錄相應(yīng)Ct值和溶解曲線，所有樣品均重復(fù)檢3 次。以2-△△Ct法對目的基因進行相對定量分析。引物通過引物設(shè)計軟件oligo6 自行設(shè)計，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測ACO1 蛋白表達

取腫瘤組織0.1 g，充分剪碎放入EP 管中加入鋼珠和RIPA 裂解液，將EP 管放入組織勻漿機中充分裂解 30 min；4℃，12 000 r·min-1離心 15 min，提取其總蛋白上清液，用BCA 法按說明書測定蛋白濃度。以GAPDH 為上樣內(nèi)參對照。將各組蛋白調(diào)至等濃度后進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉，TBST 洗膜3 次，加入一抗（1：6 000），4℃孵育過夜；洗膜，加二抗（1：6 000），顯影，曝光。采用Alpha view SA 圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.5 ELISA檢測FFA、CHO的含量

取腫瘤組織上清液，按ELISA 試劑盒說明書進行標準操作。然后將反應(yīng)好的96 孔板放入酶標儀中以450 nm 波長測定各孔的A，最后依據(jù)標準孔A繪制出標準曲線，按曲線方程計算各樣品濃度值。

2.6 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 清燥救肺湯對荷Lewis 小鼠肺癌細胞ACO1 蛋白含量及ACL mRNA表達的影響

圖1 荷Lewis小鼠肺癌組織ACO1蛋白表達電泳

與模型組比較，CTX 組及清燥救肺湯高、中、低劑量組ACO1 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）；與CTX組比較，清燥救肺湯高、中、低劑量組ACO1 蛋白表達升高（P＜0.01）；與清燥救肺湯高劑量組相比，中、低劑量組 ACO1 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01）；與清燥救肺湯中劑量組相比，低劑量組ACO1 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，CTX 組及清燥救肺湯高、中、低劑量組肺癌細胞中ACL mRNA 表達降低(P＜0.01)；與CTX 組相比，清燥救肺湯高、中、低劑量組中ACL mRNA 表達升高（P＜0.01）；與清燥救肺湯高劑量組相比，清燥救肺湯中、低劑量組ACL mRNA 表達升高（P＜0.01）；與中劑量組相比，低劑量組中 ACL mRNA 表達升高（P＜0.01），見表 2及圖1。

3.2 清燥救肺湯對荷Lewis 小鼠肺癌細胞CHO 濃度及FFA濃度的影響

與模型組比較，CTX 組及清燥救肺湯高、中、低劑量組CHO 濃度降低（P＜0.01）；與CTX 組相比，清燥救肺湯高、中、低劑量組中CHO 濃度升高（P＜0.05，P＜0.01）；與清燥救肺湯高劑量組比較，中、低劑量組CHO 濃度升高（P＜0.05，P＜0.01）；與中劑量組比較，低劑量組CHO 濃度升高（P＜0.05）。與模型組比較，清燥救肺湯高、中、低劑量組及化療組FFA 濃度降低（P＜0.01）；與CTX 組相比，清燥救肺湯高、中、低劑量組中FFA 濃度升高（P＜0.01）；與清燥救肺湯高劑量組比較，中、低劑量組FFA 濃度升高（P＜0.01）；與中劑量組比較，低劑量組FFA 濃度升高（P＜0.01），見表3。

表2 清燥救肺湯對荷Lewis小鼠肺癌細胞ACL mRNA表達及ACO1蛋白的影響(,n=5)

表2 清燥救肺湯對荷Lewis小鼠肺癌細胞ACL mRNA表達及ACO1蛋白的影響(,n=5)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與CTX組比較##P＜0.01；與高劑量組比較●P＜0.05，●●P＜0.01；與中劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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表3 清燥救肺湯對荷Lewis小鼠肺癌細胞CHO濃度及FFA濃度的影響(,n=5)

表3 清燥救肺湯對荷Lewis小鼠肺癌細胞CHO濃度及FFA濃度的影響(,n=5)

注：化療組為隔日給藥；與模型組比較，**P＜0.01；與CTX 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與高劑量組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01；與中劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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4 討論

腫瘤細胞不同于正常細胞，其以更頻繁的分裂增殖為特征，其代謝必然會發(fā)生重大改變。三羧酸循環(huán)作為人體糖、脂、蛋白質(zhì)代謝的關(guān)鍵途徑和最終通路，該循環(huán)過程中產(chǎn)生檸檬酸、游離脂肪酸、膽固醇等多種中間代謝產(chǎn)物，進而為腫瘤細胞快速增殖提供了大量的原材料[11]。亦有研究[12-13]表明，三羧酸循環(huán)的新陳代謝重新編排是腫瘤細胞的重要特點，該循環(huán)中的關(guān)鍵激酶如ACL、ACO1 及其代謝產(chǎn)物參與了腫瘤的發(fā)生過程。

腫瘤細胞脂肪酸合成增強，導(dǎo)致三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）檸檬酸裂解酶的過量表達及活性升高[14]。ACL 作為脂肪酸合成的調(diào)控酶，可在胞質(zhì)中將檸檬酸分解為草酰乙酸和乙酰輔酶A，乙酰輔酶A 不僅是內(nèi)源性脂肪酸合成的主要原料，亦是合成膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。因此ACL 是脂質(zhì)代謝與糖代謝(產(chǎn)能)之間的橋梁，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)ACL 在肺癌、胃癌及肝癌等多種腫瘤疾病中表達升高或活化增強[15]。小干擾RNA 或應(yīng)用藥物抑制ACL，能減緩腫瘤細胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡。在本實驗中，PCR 結(jié)果顯示清燥救肺湯高、中、低劑量組ACL mRNA 表達均低于模型組，提示清燥救肺湯可能通過抑制ACL mRNA 酶，減少三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物，進而抑制肺癌細胞合成。

三羧酸循環(huán)通過底物水平磷酸化有效地催化乙酰 輔 酶 A 成 為 CO2，并 同 時 產(chǎn) 生 NADP，NADH2 和ATP。NADP，NADH2 通過氧化磷酸化最終產(chǎn)生ATP，ACO1 又稱烏頭酸水合酶或檸檬酸(異檸檬酸)裂解酶，是三羧酸循環(huán)途徑中不可缺少的關(guān)鍵酶，也是NO 和H2O2等活性氧作用的主要靶點[16]，能催化檸檬酸經(jīng)順烏頭酸最終生成異檸檬酸。研究[17]顯示，抑制順烏頭酸酶會影響三羧酸循環(huán)效率，同時還能引起線粒體膜電位下降，氧化磷酸化效率的降低，最終造成線粒體的能量合成下降。本實驗中Western blot結(jié)果顯示，清燥救肺湯高、中、低劑量組肺癌細胞ACO1蛋白表達量均低于模型組，表明清燥救肺湯抑制肺癌細胞能量生成，ACO1可能是其效應(yīng)靶點之一。

脂肪酸是細胞構(gòu)建膜磷脂的基本原料，腫瘤細胞具有不斷增殖的特征，其增殖需大量脂肪酸[18]。因此，脂肪酸的合成增強，是腫瘤細胞代謝改變的另一重要特征。腫瘤細胞可利用從頭合成途徑產(chǎn)生脂肪酸從而維持自身的增殖與存活[19-20]，通過化學抑制或敲減其生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因可有效減少腫瘤細胞的增長[21]。此外，脂肪酸合成通路的活化也與腫瘤患者無病生存期縮短及預(yù)后不良密切相關(guān)。流行病學研究[22]顯示，在肺癌、結(jié)腸癌、腎癌和乳腺癌等多種腫瘤組織中，F(xiàn)FA 表達及活性增加，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。膽固醇是構(gòu)成細胞膜的重要成分，脂質(zhì)雙分子中脂筏結(jié)構(gòu)是其關(guān)鍵組成部分。惡性腫瘤細胞增殖時，膽固醇攝取增多、合成加速。Sok 等[23]研究表明膽固醇水平＜5.3 mmol/L 的患者總生存率顯著低于高膽固醇組患者，提示非小細胞肺癌患者術(shù)前總膽固醇水平與術(shù)后預(yù)后有關(guān)。亦有研究[24]發(fā)現(xiàn)，細胞膜上的膽固醇增加能誘導(dǎo)脂筏聚集，吸引表皮生長因子受體（EGFR）及Ras 等蛋白到脂筏中，這些蛋白受刺激后被激活，通過信號傳導(dǎo)，從而促進腫瘤發(fā)生。本實驗中ELISA 結(jié)果提示，清燥救肺湯高、中、低劑量組肺癌細胞中膽固醇及脂肪酸表達量低于模型組，表明清燥救肺湯能抑制肺癌細胞增殖可能是通過減少腫瘤細胞合成原材料，抑制其脂質(zhì)合成。

中醫(yī)藥在肺癌綜合治療模式中占有越來越重要的地位，其在促進患者術(shù)后恢復(fù)，減輕放化療副作用、有效延長患者生存期方面具有獨特優(yōu)勢。清燥救肺湯主治燥熱傷肺，氣陰兩傷證，與肺癌燥熱病證十分相符，實驗與臨床研究均證實清燥救肺湯具有良好的抗肺癌效果。本研究結(jié)果表明，清燥救肺湯能有效抑制荷Lewis 肺癌細胞能量代謝，減少相關(guān)代謝產(chǎn)物生成，其機制可能與下調(diào)ACL mRAN 及ACO1的表達，并降低癌細胞中FFA、CHO 含量有關(guān)，但該方對上述調(diào)控機制仍需進一步深入的研究。