張璐璐 ，包 梅 ，楊偉峰 ，呂 誠 ，肖 誠 ，官福蘭 ，易劍峰 ，李 立，呂 朗，王 毅，譚 勇＊＊

（1. 宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院 宜春 336000；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究所 北京 100700；3. 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心 北京 100700；4. 中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所 北京 100029；5. 美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理系 紐黑文 CT06520；6. 創(chuàng)新天然藥物與中藥注射劑國家重點實驗室 贛州 341000）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MethicillinresistantStaphylococcus aureus，MRSA）是臨床上常見的毒性較強的細(xì)菌，自首次發(fā)現(xiàn)以來，在全球的影響范圍逐年遞增，現(xiàn)已是院內(nèi)及社區(qū)最主要的感染病原菌之一[1，2]。臨床上針對MRSA 感染多采用抗生素療法，代表藥有糖肽類萬古霉素和噁唑烷酮類利奈唑胺[3]。近年來國內(nèi)外有關(guān)耐萬古霉素金黃色葡萄球菌和耐利奈唑胺金黃色葡萄球菌的臨床分離株多有報道，這些抗生素對MRSA的敏感性降低，且其價格昂貴、使用限制多，在臨床治療中逐漸顯示出不足之處[4，5]。積極探索新的藥物替代治療方案已成為目前有效應(yīng)對MRSA感染的緊迫任務(wù)。

頭孢西?。–efoxitin，F(xiàn)OX）是二代頭孢菌素，曾作為臨床治療MRSA 的一線用藥，聯(lián)合其他β-內(nèi)酰胺類抗生素對社區(qū)獲得性的MRSA 感染具有協(xié)同抑制作用[6]。穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide，AG）作為一種二萜內(nèi)酯化合物，可從爵床科植物穿心蓮內(nèi)分離純化得到，是穿心蓮的活性成分之一，具有清熱解毒、免疫調(diào)節(jié)等作用[7]。有研究表明AG 對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）生物膜（Biofilm，BF）的生長具有抑制作用[8]。AG 難溶于水，故通常經(jīng)過獨特的磺化工藝制成穿心蓮內(nèi)酯總磺化物（Andrographolide total sulfonate，AS）以增強水溶性、提高生物利用度[9]。AS是AG使用中的替代品。

FOX 聯(lián)合AS 可能對MRSA 發(fā)揮協(xié)同抑菌作用。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測AS 聯(lián)合FOX 對MRSA 的作用機制，并根據(jù)在不同濃度配比下FOX 和AS 聯(lián)合對 MRSA BF 生長的影響，觀察 AS 對 FOX 抗MRSA 活性的協(xié)同增效作用。本研究為臨床上AS 聯(lián)合FOX 治療MRSA 感染及減輕MRSA 耐藥提供依據(jù)，冀希開辟中西藥聯(lián)用治療感染性疾病的新思路和新方法。

1 材料

1.1 藥物靶蛋白和MRSA相關(guān)基因

在 ChEMBL、ETCM 和 PubChem 數(shù)據(jù)庫檢索 AS 和FOX 的靶蛋白，剔除非實證獲得和重復(fù)者，入選的AS靶蛋白 20 個，F(xiàn)OX 靶蛋白 65；在 Ensembl Bacteria、Uniprot 和PubMed 數(shù)據(jù)庫中檢索MRSA 致病相關(guān)基因，剔除重復(fù)者，共入選80個基因。

1.2 菌株

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（ATCC 43300）購自美國ATCC公司。

1.3 主要藥物與試劑

穿心蓮內(nèi)酯總磺化物標(biāo)準(zhǔn)品（生產(chǎn)批號：20181018）；頭孢西?。↖D：WN67-8BC6）購自中國食品藥品監(jiān)督管理局；胰蛋白胨（LP0024）和酵母提取物（LP0021）為英國OXOID 公司產(chǎn)品；XTT（X4626）、PMS（P-9625）和TTC（17779-10X10ML-F）為美國Sigma 公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國伯樂公司生產(chǎn)；分光光度計為上海美譜達(dá)儀器廠生產(chǎn)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱由上海森信實驗儀器有限公司生產(chǎn)；恒溫?fù)u床由上海孫坤生產(chǎn)；高壓滅菌鍋由日本三洋企業(yè)生產(chǎn)。

2 方法

2.1 AS和FOX干預(yù)MRSA的作用和機制預(yù)測

參考筆者以往的類似研究，把AS、FOX 的靶蛋白及MRSA 相關(guān)基因進行格式歸一化處理，然后導(dǎo)入IPA 網(wǎng)絡(luò)分析平臺，采用Network analysis 功能模塊構(gòu)建藥物靶蛋白網(wǎng)絡(luò)和MRSA 基因網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)的映射分析，發(fā)現(xiàn)AS和FOX干預(yù)MRSA的相關(guān)靶點[10，11]。

2.2 藥物最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）測定

從MRSA平板中挑取單菌落置于3mL LB培養(yǎng)基，37℃、280r·min-1震搖18h。翌日取出菌液，通過分光光度計檢測600nm吸光度值，用LB培養(yǎng)基稀釋菌液至A600=0.02，采取標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法分別檢測AS、FOX 對 MRSA 的 MIC 值。取無菌 96 孔板，倍比稀釋藥液，其中AS的濃度梯度為50-0.098mg·mL-1，F(xiàn)OX濃度梯度為 64-0.125μg·mL-1，每孔 100μL，再加入菌液100μL。同時設(shè)置陰性對照孔和陽性對照孔，其中陰性對照孔僅添加200μL LB 培養(yǎng)基，陽性對照孔加入200μL 菌液。37℃、80%RH 培養(yǎng) 24h 后每孔添加0.25%TTC 30μL，繼續(xù)培養(yǎng)30min，肉眼直接觀察培養(yǎng)孔內(nèi)呈現(xiàn)顏色，紅色代表孔內(nèi)含菌，以陰性對照孔為參考，判斷MIC值。實驗重復(fù)3次。

2.3 AS與FOX作用的最佳抑菌濃度比的確定

采用棋盤法[12，13]。培養(yǎng)基菌液稀釋同方法2.2。使用96孔板，分別對AS、FOX進行倍比稀釋。在96孔板中取8 個孔依次橫向梯度稀釋AS 至7 個梯度，梯度范圍為 25-0.391mg·mL-1。另取一塊新 96 孔板取 8 個孔縱向梯度稀釋FOX 至7 個梯度，梯度范圍為32-0.5μg·mL-1。從已稀釋不同濃度的AS 孔板中用排槍各吸取50μL，從FOX 孔板第二列依次轉(zhuǎn)移，使得孔板第一列及最后一行中僅含有FOX 或AS，其中填補50μL LB 培養(yǎng)基。最后于所有待測孔內(nèi)加入100μL菌液，37℃、80%RH培養(yǎng)24h。

以分?jǐn)?shù)抑制濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）評判藥物體外的相互作用情況。計算公式為：FICI=MICA/A+MICB/B，公式中A 和B 代表 A 藥和 B 藥各自單用時的 MIC；MICA 和 MICB代表 A 藥和 B 藥聯(lián)用時各自的 MIC。當(dāng) FICI≦0.5 為協(xié)同作用；FICI=0.5-1.0 為相加作用；FICI=1.0-2.0 為無關(guān)作用；FICI＞2.0為拮抗作用。

2.4 AS 和FOX 各自單用和聯(lián)用對成熟MRSA BF 的影響測定

2.4.1 AS和FOX各自單用對成熟MRSA BF的影響

采用微孔板法[14]。MRSA接種方法同2.2，用LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至A600=0.1。于無菌96 孔板中各孔添加菌液100μL，37℃、80%RH 培養(yǎng)24h，生長出成熟的MRSA BF。取一塊新96 孔板稀釋藥液，AS 的濃度梯度 為 50-0.098mg·mL-1，F(xiàn)OX 的 濃 度 梯 度 為 32-0.0625μg·mL-1，每孔100μL 轉(zhuǎn)移至含菌孔板內(nèi)，37℃、80%RH 培養(yǎng)24h。采用0.9%氯化鈉溶液洗滌96 孔板兩次，除去孔中未貼壁的細(xì)菌，以XTT-PMS（200：1）染液每孔加入40μL進行BF染色，使用酶標(biāo)儀檢測BF內(nèi)活菌量（XTT-PMS 450nm）。

2.4.2 AS和FOX聯(lián)用對成熟MRSA BF的影響

采用微孔板法。培養(yǎng)基菌液稀釋、培養(yǎng)成熟MRSA BF同方法2.4.1。根據(jù)最佳抑菌濃度比，配置相應(yīng)濃度的AS 及FOX，AS 的濃度選取為1/2MIC（25mg·mL-1）、1/4MIC（12.5mg·mL-1），F(xiàn)OX 的濃度選取為 1/2MIC（16μg·mL-1）、1/4MIC（8μg·mL-1）、1/8MIC（4μg·mL-1），兩兩聯(lián)合各 50μL 組成 1/2MIC FOX+1/2MIC AS、1/2MIC FOX+1/4MICAS、1/4MIC FOX+1/2MIC AS、1/4MIC FOX+1/4MIC AS、1/8MIC FOX+1/2MIC AS加入含菌孔板中，37℃、80%RH培養(yǎng)24h。染色及檢測方法同2.4.1。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS軟件進行單因素方差分析，方差齊者采用LSD 進行兩兩對比，方差不齊者進行Dunnet’T3 分析，采用Pearson 法分析被膜內(nèi)抑菌量與劑量依賴關(guān)系的相關(guān)性，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 AS和FOX干預(yù)MRSA的作用特點和機制

如圖1 所示，AS 網(wǎng)絡(luò)通過溶細(xì)胞毒素（Staphylolysin α，Hla）、潘 頓 瓦 倫 丁 殺 白 細(xì) 胞 素（Panton-Valentine Leukocidin Toxin，PVL）和纖維連接蛋白結(jié)合蛋白B（Fibronectin Binding Protein B，F(xiàn)nbB）影響 MRSA 網(wǎng)絡(luò)，F(xiàn)OX 網(wǎng)絡(luò)通過 Hla、PVL、Atl 和 SarA影響 MRSA 網(wǎng)絡(luò)；AS 和 FOX 共同的作用點 Hla 和 PVL屬于 MRSA 的毒力因子，Atl和 SarA 與 MRSA 的致病性相關(guān)；FnbB是耐藥BF形成的關(guān)鍵分子。提示AS、FOX對MRSA 有聯(lián)合抑制作用，并且推測AS 通過抑制MRSA BF提高FOX對MRSA的敏感性。

3.2 AS、FOX 對 MRSA 的 MIC 值及聯(lián)用最佳抑菌濃度比

AS、FOX 對 MRSA 的 MIC 值分別為 50mg·mL-1和32μg·mL-1（圖2、表1），并據(jù)此確定棋盤法的起始濃度。AS 和FOX 聯(lián)用對MRSA 最佳抑菌濃度比實驗結(jié)果表明，AS 與FOX 聯(lián)用濃度不同則表現(xiàn)出不同的抗菌效果（圖3、表1）。AS 和FOX 聯(lián)用，以25mg·mL-1AS（單用時MIC 的1/2）+4μg·mL-1FOX（單用時MIC 的1/8）作用效果最佳，F(xiàn)ICI值=0.625，表現(xiàn)為相加作用。結(jié)果提示，AS 與 FOX 聯(lián)用可提高 MRSA 對 FOX 的敏感性。

圖1 AS和FOX干預(yù)MRSA的分子網(wǎng)絡(luò)

圖2 AS、FOX對MRSA的MIC值

圖3 AS與FOX聯(lián)用最佳抑菌濃度比

表1 AS和FOX各自單獨及聯(lián)用對MRSA的MIC、FICI及作用方式

3.3 AS、FOX對MRSA BF的作用

3.3.1 單用AS、FOX對MRSA BF的作用

如圖 4 所示，當(dāng) MRSA BF 成熟后，F(xiàn)OX 單用對膜內(nèi)活菌數(shù)無顯著影響；AS單用可影響B(tài)F內(nèi)的活菌量，8 個濃度劑量（50-0.391mg·mL-1）均產(chǎn)生抑菌效果，并存在劑量依賴關(guān)系，提示AS 能使BF 外層膜結(jié)構(gòu)破損而滲透入膜內(nèi)、殺滅膜內(nèi)細(xì)菌。

3.3.2 聯(lián)用AS、FOX對MRSA BF的作用

如圖5 所示，AS 與FOX 聯(lián)用優(yōu)于兩藥單用效果，可顯著影響B(tài)F 內(nèi)活菌量；FOX 不同濃度劑量變化對聯(lián)用效果沒有影響，而AS 濃度劑量不同、聯(lián)用效果不同。1/2MIC AS 與FOX 聯(lián)用作用效果優(yōu)于1/4MIC AS與FOX 聯(lián)用。結(jié)果提示，AS 與FOX 聯(lián)用的最佳濃度比為1/8MIC FOX+1/2MIC AS。

4 討論

如今由MRSA 造成的感染性疾病逐年增加，MRSA 的院內(nèi)感染主要分布于呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科、ICU 等，來自 Mohnarin2010 年度的報告，MRSA 在 ICU中的檢出率高達(dá)79.4%。感染率之高，影響范圍之廣，對全球公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[15，16]。MRSA 作為目前世界上嚴(yán)重的多藥耐藥菌之一，多種抗生素均已產(chǎn)生耐藥反應(yīng)。MRSA 具有S. aureus可形成細(xì)菌BF的重要特性。BF 的概念最早是Costerton 于1978 年提出[17]，BF 不同于其他耐藥機制具有特異性，BF 是任何一種細(xì)菌在生長過程中為適應(yīng)環(huán)境變化，細(xì)菌聚集成團，在菌體外圍分泌出可附著于物體表面的物質(zhì)，這是一種與浮游細(xì)菌截然相反的存在形式[18]。因此探索發(fā)現(xiàn)針對治療細(xì)菌BF 的有效藥物和治療方案始終是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點話題。MRSA 通過BF 附著于人體內(nèi)部組織器官或置入性醫(yī)療器械表面，機體的免疫系統(tǒng)、呼吸道黏膜上纖毛的擺動、胃腸道蠕動及尿液沖刷等生理活動均難去除入侵的MRSA，BF 的屏障作用有效的阻礙了抗菌藥物對膜內(nèi)深層細(xì)菌的殺滅作用，抗生素、化學(xué)消毒劑等亦難以滲透其中，是臨床中導(dǎo)致耐藥產(chǎn)生的重要原因[19]，造成各種慢性難治性感染使MRSA的臨床治療難度加倍。FOX屬于第二代頭孢類抗生素，曾經(jīng)是治療MRSA 的一線藥物，如今因MRSA 對其敏感性降低而較少用于臨床。AS 作為傳統(tǒng)中藥穿心蓮活性成分提取物的磺化物，長期運用于抗炎抗菌等治療?，F(xiàn)研究表明AG 在體外可對MRSA BF 產(chǎn)生抑制作用，并存在劑量依賴關(guān)系[20，21]。本研究探索AS 聯(lián)合FOX 干預(yù)MRSA 的作用，為臨床有效治療MRSA感染開拓新的用藥思路和用藥方案。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)進行藥效及其機制預(yù)測是當(dāng)前藥物研究的重要手段，具有高通量、高效率、低成本、研究結(jié)果穩(wěn)定可靠的特點，廣泛應(yīng)用在實證研究前的預(yù)研究，能夠為實證研究假說的提出提供依據(jù)。通過既往文獻(xiàn)報道網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法可以探討兩藥之間相互作用特征及其機制[22]。本研究首先采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測AS 和FOX 對MRSA 的作用特點和機制，發(fā)現(xiàn)AS 和 FOX 均 對 MRSA 毒 力 因 子 基 因 Atl 和 SarA 有 影響，AS 的作用特點也表現(xiàn)出影響耐藥BF 形成的關(guān)鍵基因是FnbB。本研究也開展了AS和FOX各自單獨及聯(lián)合干預(yù)MRSA的體外實驗，采用棋盤法、微孔板法發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合干預(yù)MRSA 具有相加效應(yīng)，F(xiàn)OX 對成熟的MRSA BF 不具任何作用，而 1/2MIC（25mg·ml-1）的 AS即能夠破壞BF 而使 FOX 僅1/8MIC（4μg/ml）即可有效接觸膜內(nèi)深層細(xì)菌發(fā)揮抑菌效果，明顯減低抗生素使用劑量。

圖4 微孔板法檢測AS與FOX對MRSA BF的影響

圖5 微孔板法檢測AS與FOX聯(lián)用對MRSA BF的影響

Hla是編碼MRSA主要毒力因子α溶血素的基因，α溶血素的作用可造成紅細(xì)胞、白細(xì)胞的損傷，甚至可進一步危害皮膚細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞[23]。PVL 編碼殺白細(xì)胞素，其通過膜損傷機制致使宿主細(xì)胞破裂解離，主動攻擊各類器官組織細(xì)胞造成宿主產(chǎn)生貧血、毛細(xì)血管出血、白細(xì)胞銳減、皮膚壞死、心肌壞死、化膿性炎癥等不良癥狀[24]。AS 和FOX 可能共同作用于這兩個靶點對MRSA 發(fā)揮聯(lián)合抑制作用。MRSA BF的生成一部分歸因于其細(xì)胞表面蛋白識別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組分（microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMM）的表達(dá)，F(xiàn)nbB 是 MSCRAMM 家族的多功能蛋白質(zhì)[25，26]。有研究小組證明，F(xiàn)nbB 基因缺失的突變體菌株中BF的形成銳減[27]。AS 可能通過抑制FnbB 的表達(dá)而破壞BF。已有研究發(fā)現(xiàn)，AS 在體內(nèi)實驗中證實其環(huán)糊精包合物可通過抑制環(huán)氧化酶（Cyclooxygenase-2，COX-2）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）激活、凋亡蛋白表達(dá)及調(diào)控各類細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6）來減少巨噬細(xì)胞中的免疫反應(yīng)間接抑制細(xì)菌性炎癥，從而達(dá)到抗菌作用[20，21]。AS 與 FOX 的聯(lián)用既可能通過抑制BF 使抗生素更易于發(fā)揮抗菌作用，又可能從人體免疫方向AS 類似NF-κB 抑制劑的作用幫助人體減少因感染而引起的強烈免疫損傷。同時因細(xì)菌難以對作用于免疫系統(tǒng)的藥物產(chǎn)生抗藥性，這也很好的解決了細(xì)菌易耐藥的問題。

總之，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測和體外細(xì)菌實驗確認(rèn)AS 聯(lián)合FOX 對抗MRSA 存在相加作用，其機制與兩藥聯(lián)合抑制MRSA 毒力因子有關(guān)。AS 單用對MRSA BF 存在明顯抑制作用，而FOX 無此作用，致使FOX 無法透膜對MRSA 發(fā)揮抑殺作用。在AS 聯(lián)用FOX時，對MRSA的作用均優(yōu)于兩者單用的效果，減少抗生素使用劑量，提高了MRSA對藥物的敏感性，降低耐藥風(fēng)險。故本研究為AS 及AS 聯(lián)合FOX 體內(nèi)抗MRSA 感染研究奠定基礎(chǔ)，在進一步的研究中將通過動物體內(nèi)實驗探索兩藥聯(lián)用的體內(nèi)轉(zhuǎn)化過程及效應(yīng)機制，為臨床上AS 聯(lián)合FOX 治療MRSA 感染及減輕MRSA 耐藥提供依據(jù)。本研究開辟了中西藥聯(lián)合作用治療感染性疾病的新思路和新方法。