張致呈,劉 燕,趙志剛,李貴文

（皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002）

亞側(cè)耳,又叫做元蘑(產(chǎn)地黑龍江一帶）、冬蘑、黃蘑,形似扁狀半圓形和腎臟形,以黃綠色為主,有一定粘度。亞側(cè)耳主要生長在腐爛的闊葉樹中,分布在北方、川藏地區(qū),是一種木腐朽菌,可以食用[1]。中醫(yī)學(xué)理論認為,亞側(cè)耳性甘、溫和,可以祛火清熱,排除濕氣,在治療肝硬化、癲癇等方面有顯著效果,同時還能夠減輕肌肉疼痛,消除眼睛紅腫、脹痛等病癥[2]。多糖是亞側(cè)耳的主要成分,也是有藥用價值的部分,亞側(cè)耳多糖一方面可以直接殺傷腫瘤細胞,另一方面還可以免疫調(diào)節(jié)人體。亞側(cè)耳多糖能夠降低輻射所致的免疫功能損傷影響,而且還能增強機體的防御能力,同時還能降低和修復(fù)化療藥物對機體免疫系統(tǒng)的破壞,起到增效減毒的作用,它體現(xiàn)了中醫(yī)的精髓[3-4]。目前,關(guān)于亞側(cè)耳的研究多集中于藥理方面,而在提取工藝方面的研究較少,本次試驗首次采用正交設(shè)計對微波輔助提取亞側(cè)耳多糖的工藝條件進行優(yōu)化,為亞側(cè)耳活性多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

RE5298標(biāo)準(zhǔn)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠；MD6A微波樣品處理系統(tǒng),北京盈安美誠科學(xué)儀器有限公司；UV-5100紫外可見分光光度計,上海元析第三分析儀器廠；AB104-N電子分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司。

亞側(cè)耳(購于毫州藥材市場）；95%乙醇、葡萄糖、濃硫酸、氯仿、正丁醇、苯酚、無水乙醇等均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖含量的檢測

用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品,采用硫酸—苯酚法進行檢測[5]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取六只50 mL容量瓶,將已經(jīng)烘干過的葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品配置所需要的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取 0 mL、3 mL、6 mL、9 mL、12 mL、15 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液加入容量瓶中,分別添加一定量蒸餾水定容搖勻。從上面得到的六只容量瓶中各自取1 mL溶液加入試管中,依次將0.6 mL 5%的苯酚溶液和3 mL濃硫酸加入試管中,振蕩使它們充分混合均勻,然后把試管放入60℃水中開始恒溫反應(yīng)20 min,等待反應(yīng)完畢后,停止加熱,將試劑冷卻至室溫,把試劑樣品放入分光光度計,選擇波長為490 nm進行吸光度測量,結(jié)合測量數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到如下回歸方程:

式中:A——吸光度

C——葡萄糖濃度, μg/mL

1.2.3 微波輔助萃取方法

將亞側(cè)耳原材料干燥后粉碎經(jīng)石油醚、乙醇脫脂,然后乙醇提取,去除其中的醇溶性雜質(zhì)和單糖,過濾后殘渣晾干備用,稱取5 g除脂后的亞側(cè)耳粉,加入規(guī)定用量的溶劑,靜置一定時間潤濕物料,然后恒溫條件下微波提取一定時間,累計提取兩次,抽濾提取劑,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到原體積的1/5左右,除去蛋白質(zhì),醇沉后用無水乙醇淋洗,取出干燥得粗多糖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取時間對得率的影響

觀察圖1中曲線走勢,不難發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度等其他因素保持不變時,微波提取時間不斷變大,曲線持續(xù)上升,提取得率也在上升,提取時間到達10 min時,提取得率也隨之到達最大值,發(fā)現(xiàn)提取時間超過10 min后,如果繼續(xù)提取,時間并不影響亞側(cè)耳多糖的提取得率,時間越長反而有所下滑,說明此時多糖已經(jīng)基本完全溶解提取,時間過長多糖發(fā)生其他反應(yīng)分解。因此10 min是多糖最佳的微波提取時間。

圖1 提取時間對得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on yield

2.1.2 液料比對得率的影響

圖2 液料質(zhì)量比對提取得率的影響Fig.2 Effect of liquid mass ratio on extraction yield

觀察圖2,當(dāng)提取時間等其他條件保持不變時,當(dāng)液料比逐漸上升的時候,亞側(cè)耳多糖的得率也逐漸提高,在液料比為30∶1的時候達到最大值,繼續(xù)增加液料比得率基本不變甚至有所下降,可能是液體量太多影響結(jié)果。因此經(jīng)過多種考慮選擇30∶1的液料比最佳。

2.1.3 提取溫度對得率的影響

根據(jù)圖3曲線走勢不難發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度為70℃時得率為峰值,表示此溫度下多糖基本被全部提取。溫度過高得率下降可能是多糖在高溫下發(fā)生分解。因此微波提取的最佳溫度為70℃。

圖3 提取溫度對提取得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield

2.1.4 提取次數(shù)對得率的影響

由圖4曲線走勢可知,當(dāng)提取次數(shù)為2時,得率已經(jīng)接近最大值,次數(shù)增加得率緩慢上升后基本不變,表明提取兩次已基本提取完全。因此微波提取的最佳提取次數(shù)為2。

圖4 提取次數(shù)對得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on yield

2.2 正交實驗

表1 實驗因素水平Table 1 Factor level of experiment

為了優(yōu)化微波提取工藝,了解各因素之間相互關(guān)系和影響范圍。將溫度(A）、亞側(cè)耳多糖的液料比(B）、亞側(cè)耳多糖的微波提取次數(shù)(C）、亞側(cè)耳多糖的提取時間(D）四個因素進行正交實驗,選擇使用L9(34）正交表。正交實驗結(jié)束后,結(jié)合實驗數(shù)據(jù)和正交表,判斷提取得率和它們的關(guān)系,明確了影響因素的優(yōu)先級順序:A＞D＞C＞B,同時,聯(lián)系社會生產(chǎn)實際過程,得到最佳提取工藝條件為 A3B3C2D2。即:設(shè)置提取溫度為80℃,將亞側(cè)耳多糖的液料比確定在35∶1,分別提取兩次,每次都提取10 min,此時提取效果最佳。同時為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,以正交實驗得到的最佳工藝條件為基礎(chǔ)進行平行試驗,計算得率的平均值,結(jié)果為15.16%。由此可見,實驗結(jié)果是可以再現(xiàn)的,有效的。

表2 正交實驗設(shè)計表及結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment chart and result

3 結(jié) 論

通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化了提取工藝,本實驗結(jié)果表明,在溫度為80℃條件下,對液料比為35∶1的亞側(cè)耳重復(fù)提取兩次,每次10 min,此時的得率最高。相比傳統(tǒng)方法,微波提取技術(shù)有效提升了亞側(cè)耳多糖的提取率,同時可以縮短提取時間,簡化提取工藝,在工業(yè)化生產(chǎn)過程中有一定指導(dǎo)作用。