劉文欣,馮 芳,2

（1中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇 南京 210009；2藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009）

中藥經(jīng)典名方因其確切的療效和較小的毒副作用,從古至今一直沿用,并且被世界上越來越多的國家所接受,中藥現(xiàn)代化和國際化是大勢所趨[1]。目前,針對中藥的研究越來越多,包括中藥的質(zhì)量標準研究,活性成分研究,藥效及毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究等,在這之中,中藥體內(nèi)代謝物的鑒別是關(guān)鍵一環(huán),這對于了解中藥在體內(nèi)的吸收代謝過程和闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義[2]。

然而,在傳統(tǒng)的中藥代謝物鑒別過程中仍然存在著諸多問題:首先,中藥體系復(fù)雜,化合物種類多,且進入體內(nèi)后需要經(jīng)歷復(fù)雜多樣的代謝過程；其次,吸收入血成分及代謝物成分含量非常低,常規(guī)檢測方法難以滿足；最后,生物基質(zhì)復(fù)雜,代謝物的鑒別過程受到內(nèi)源性物質(zhì)的干擾[3]。

為了解決上述困境,科研工作者做出了很多的努力,越來越多的高精密儀器和新策略涌現(xiàn)出來。其中,高分辨質(zhì)譜(HRMS）應(yīng)運而生[4],并且基于HRMS衍生出了很多代謝物鑒別的新策略,下文將對目前比較常用的基于HRMS的中藥代謝物策略綜述,分析各個策略的優(yōu)劣,以期建立更加高效、可靠的中藥代謝物鑒別策略。

1 高分辨質(zhì)譜（HRMS）的介紹

1.1 HRMS的原理

高分辨質(zhì)譜由真空系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器以及檢測接收器幾部分構(gòu)成,其原理與其他類型的質(zhì)譜一樣,也是先將物質(zhì)離子化,并按照質(zhì)荷比分離,最后通過測定各離子峰的強度達到分析目的[5]。目前使用較多的高分辨質(zhì)譜,主要包括飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS）、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR-MS）和靜電場軌道阱質(zhì)譜(Orbitrap-MS）等,并且均可以和四級桿或離子阱相串聯(lián)以提高其性能[4]。

TOF-MS通過固定離子飛行距離,根據(jù)不同質(zhì)量離子的飛行時間不同,從而到達檢測器的時間不同,質(zhì)量小的先到達,從而實現(xiàn)對不同質(zhì)量離子的檢測,具有快速、高靈敏度和高分辨率的特點[6]。FTICR-MS是一種根據(jù)給定磁場中的離子回旋頻率來測量離子質(zhì)荷比的質(zhì)譜分析器,具有極高的分辨率,在質(zhì)荷比為1000時分辨率可達106,分辨率與離子質(zhì)量成反比,與磁場強度成正比,具有測定準確度高,掃描速度快,測定質(zhì)量范圍寬等優(yōu)勢,在化合物分子量測定,結(jié)構(gòu)信息獲取方面應(yīng)用廣泛[5]。Orbitrap-MS采用了靜電場軌道阱作為離子的旋轉(zhuǎn)振蕩,使離子圍繞中心電極的軌道旋轉(zhuǎn)從而捕獲離子的裝置,是一種結(jié)合靜電場離子阱和快速傅里葉變換技術(shù)的新型質(zhì)譜,能夠快速、可靠地篩查、識別和定量復(fù)雜基質(zhì)樣品中的化合物[7],目前新型Orbitrap-MS的分辨率可達140000 FWHM,全掃描和全離子裂解(AIF）模式質(zhì)量準確度均優(yōu)于1 ppm,大大提高了鑒別的可靠性,是分析實驗室進行食品安全或環(huán)境篩查、臨床研究、法醫(yī)毒物學(xué)、DMPK、代謝組學(xué)和生物制藥(完整蛋白分析）應(yīng)用的理想儀器。

1.2 HRMS用于中藥代謝物鑒別的優(yōu)勢

與低分辨質(zhì)譜相比,HRMS能夠提供更加精確的前體離子和碎片離子的質(zhì)量,預(yù)測它們的化學(xué)元素組成,為代謝物的結(jié)構(gòu)推斷提供可靠信息。HRMS與超高效液相色譜(UPLC）的完美結(jié)合是目前中藥體內(nèi)代謝物鑒別的強有力手段,兼具UHPLC優(yōu)越的分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度與高專屬性。對檢測樣本處理要求低,靈敏度極高,線性范圍寬,對于樣本中濃度相差大的代謝化合物亦可達到很好的檢測效果[6],在中藥體內(nèi)代謝物的鑒別過程中應(yīng)用廣泛。

2 基于HRMS的中藥代謝物鑒別策略

在中藥代謝物的鑒別過程中,由于受基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,往往會得到數(shù)以千計的化合物,如何從這些化合物中篩選并且鑒別出代謝物是個挑戰(zhàn)。近年來,文獻中報道的一些基于HRMS的策略,能夠讓鑒別過程事半功倍。

2.1 HRMS結(jié)合多元統(tǒng)計分析的鑒別策略

多元統(tǒng)計分析一般包含無監(jiān)督的主成分分析(PCA）,有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析(PLS-DA）,正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA）,PCA能夠反映對照組和給藥組組間離散程度,PLS-DA在加入分組信息后,盡可能的減少或消除了組內(nèi)差異,強化了組間差異[2]。通過OPLS-DA能夠篩選出對組間差異貢獻較大的成分,通常以S-Plots圖中變量投影重要性指標(VIP,Variable Importance in Projection）作為衡量標準,VIP值大于1,且在生物樣本成分趨勢圖中只存在于給藥組而不存在空白組的成分即為潛在的代謝物。此策略的思路和方法主要源于代謝組學(xué),所以,也有文獻稱其為非靶標代謝組學(xué)策略[8]。

HRMS得到的原始數(shù)據(jù)首先要經(jīng)過代謝組學(xué)軟件的處理,包括峰識別,峰對齊,以及與代謝物數(shù)據(jù)庫匹配等,生成包含峰編號,保留時間-質(zhì)荷比以及離子強度的三維數(shù)據(jù)集,經(jīng)過標準化處理后,能直接導(dǎo)入到多元統(tǒng)計分析軟件進行分析,篩選出中藥體內(nèi)代謝物。常用的代謝組學(xué)處理軟件有XCMS online、 MetAlign、 MZmine、 MAVEN、 MetaboAnalyst, 以及一些商業(yè)化軟件 Mass Profiler Pro(Agilent）,Metabolic Profiler(Bruker）,Progenesis QI 2.0(Waters）等, 其中以 XCMS online 使用最多[9]。Simca-P、Ezinfo 3.0軟件是主要的多元統(tǒng)計分析軟件。

Xian-Na Li等[10]基于UPLC-MS結(jié)合多元統(tǒng)計分析對中藥復(fù)方制劑滋腎丸進行血清藥物化學(xué)研究,給藥組和對照組的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Progenesis QI 2.0軟件,生成包含每一個化合物保留時間-質(zhì)荷比以及離子強度的數(shù)據(jù)集,經(jīng)過標準化處理后上傳到Ezinfo 3.0軟件進行OPLS-DA處理,篩選血漿中的外源性成分。VIP大于1的成分依據(jù)準確的質(zhì)量和碎片離子通過UNIFI數(shù)據(jù)庫進行匹配,總共識別出33個入血成分,包含22個原型成分和11個代謝物,為其進一步藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的確定奠定了基礎(chǔ)。Kaiwen Luo等[8]利用非靶向代謝組學(xué)的手段,對梔子厚樸湯的入血成分進行鑒別,原始數(shù)據(jù)經(jīng)過XCMS處理后,導(dǎo)入到SIMCA-P軟件中,進行多元統(tǒng)計分析,對篩選出的外源性成分進行了鑒定,總共鑒別出35個原型成分和26個代謝物。

HRMS結(jié)合多元統(tǒng)計分析的優(yōu)勢是比較高效,能夠在大量內(nèi)源性物質(zhì)干擾的情況下快速篩選出外源性成分,并能通過進一步地與代謝物數(shù)據(jù)庫進行匹配,實現(xiàn)化合物的快速鑒別。另外,作為一種非靶向的鑒別策略,能夠?qū)崿F(xiàn)對未知代謝物的鑒別,減少因原型成分和代謝途徑設(shè)置不全面造成的遺漏,綜合來說,比較適合中藥復(fù)雜體系體內(nèi)代謝物的鑒別。

2.2 HRMS結(jié)合代謝物預(yù)測軟件的鑒別策略

基于代謝物預(yù)測軟件的鑒別策略是一種靶向的鑒別方法,最初用于單體化合物代謝物的識別和鑒定,近年來,隨著功能的優(yōu)化和完善,在中藥復(fù)雜體系中的應(yīng)用也越來越多[2]。目前,很多軟件和平臺都具有代謝物預(yù)測的功能,如Metabolynx、UNIFI、Peakview等,這些軟件的使用提高了鑒別的效率。在中藥鑒別過程中一般以中藥體外成分和其入血的原型成分作為母體化合物,根據(jù)設(shè)置化合物的代謝途徑和適當(dāng)?shù)倪^濾參數(shù),能夠?qū)崿F(xiàn)對代謝物的有效提取和鑒別。

除了能夠通過代謝途徑預(yù)測代謝物外,質(zhì)量虧損過濾(MDF）也是其重要技術(shù)手段。MDF的理論基礎(chǔ)是代謝物與原型成分小數(shù)部分的精確質(zhì)量數(shù)變化不大,可以通過設(shè)定較窄的質(zhì)量虧損范圍,對HRMS采集到的數(shù)據(jù)進行處理和識別,減少內(nèi)源性物質(zhì)對鑒別過程的干擾[11]。

Ran Wu等[12]基于UHPLC-Q-TOF-MS對芪精升白顆粒的體外化學(xué)成分和體內(nèi)代謝物進行了研究,在代謝物的鑒別過程中主要利用了Metabolynx代謝物預(yù)測功能。首先,自建體外化合物數(shù)據(jù)庫,體外樣品和血清樣品通過UNIFI與體外數(shù)據(jù)庫匹配,完成體外成分和入血原型成分的鑒別,Metabolynx軟件能夠基于這些化合物進行代謝物的預(yù)測,然后通過UNIFI與血清樣品再一次的匹配,最后結(jié)合中性丟失,診斷離子策略,總共鑒別出了18個代謝物(鑒別過程如圖1所示）。Tao Shi等[13]利用Metabolynx軟件結(jié)合MDF技術(shù),對參松養(yǎng)心湯的體內(nèi)代謝物進行鑒別,總共鑒別出47個代謝物,I相代謝中的氫化,羥基化,去甲基化以及II相代謝中的葡萄糖醛酸化是其主要代謝途徑。

圖1 QJSB體外和體內(nèi)化學(xué)成分鑒別策略Fig.1 The strategy for the identification of multiple components in vitro and in vivo of QJSB

HRMS結(jié)合代謝物預(yù)測軟件的優(yōu)勢是比較省時省力,但是也有可能造成代謝物的遺漏,中藥進入體內(nèi)后,除了一些常規(guī)的代謝途徑外,可能還要經(jīng)歷環(huán)氧化,過氧化以及結(jié)構(gòu)重排等類型的代謝反應(yīng),造成質(zhì)量發(fā)生較大的變化,代謝物預(yù)測軟件很難對這些化合物進行有效的預(yù)測[3]。

2.3 基于HRMS結(jié)合提取離子流圖（EIC）的代謝物鑒別策略

提取離子流圖(EIC）策略是靶向的代謝物鑒別策略,對于可預(yù)測或已知生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物適用[14]。研究者可借助SciFinder,PubMed,Web of Science,中國知網(wǎng)CNKI等數(shù)據(jù)庫進行文獻挖掘,建立代謝物數(shù)據(jù)庫,包括準確的分子量,前體離子以及碎片離子等信息,對于多藥材的復(fù)方制劑來說,可收集各單味藥材的代謝物信息。通過設(shè)定的質(zhì)荷比范圍查找該代謝物在給藥樣品中的存在情況,然后進一步通過HRMS采集的碎片離子信息對化合物的結(jié)構(gòu)進行確證。通過提取特定質(zhì)荷比離子的手段,能夠消除內(nèi)源性物質(zhì)對鑒別過程的干擾,但是,無法發(fā)現(xiàn)新的代謝物,且鑒別過程較其他策略相比工作量較大。

2.4 多種途徑聯(lián)用的代謝物鑒別策略

中藥體內(nèi)代謝物鑒別策略各有利弊,綜合使用,才能揚長避短,達到高效、準確鑒別代謝物的目標。

Nan Mi等[15]在中藥復(fù)方制劑丹梔片(DZT）大鼠體內(nèi)代謝物的鑒別過程中介紹了一種基于HRMS的集成策略,綜合了多元統(tǒng)計分析和代謝物預(yù)測兩種技術(shù)手段。如圖2所示,首先,通過UPLC-Q-TOF/MS采集空白組和給藥組血漿的質(zhì)譜信息,然后,對大量的原始數(shù)據(jù)進行分析,包括利用Progenesis QI2.0軟件進行峰識別、峰對齊和利用Ezinfo 3.0軟件進行偏最小二乘判別分析(OPLS-DA）,在VIP Plots圖中篩選VIP值大于1的作為潛在外源性成分。同時,利用UNIFI平臺對丹梔片體外成分和入血原型成分的代謝物進行預(yù)測,將篩選出的血漿外源性成分與預(yù)測的代謝物進行匹配。對于未能匹配的化合物通過中性丟失,診斷離子以及相關(guān)文獻的報道進一步鑒定,總共鑒別出了119個代謝物。本研究介紹的集成策略與多元統(tǒng)計分析相比,大大縮減了代謝物的鑒別過程；與單純依靠代謝物預(yù)測軟件相比,大大減少了代謝物遺漏的可能性。

圖2 DZT大鼠血漿代謝物鑒別策略Fig.2 The strategy for metabolite identification of DZT in rat plasma

3 結(jié) 語

高分辨質(zhì)譜(HRMS）不僅能夠提供準確的質(zhì)量數(shù),而且通過結(jié)合雜化的多功能質(zhì)譜獲得多級質(zhì)譜數(shù)據(jù),是代謝物鑒別策略得以使用的基礎(chǔ)。在數(shù)據(jù)處理過程中,多元統(tǒng)計分析、代謝物預(yù)測軟件以及提取離子色譜等策略,都具有各自的利弊,多種策略的聯(lián)合使用能提高鑒別的效率和可靠性。