趙平, 劉佳, 張穎

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物研究所,武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&湖北省醫(yī)學(xué)生物國(guó)際科技合作基地，武漢430074)

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類跨膜蛋白，每個(gè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，螺旋2、5、7和10與D-葡萄糖穿過GLUT蛋白中的空隙有關(guān)，螺旋7的殘基Gln-Leu-Ser被稱為QLS位點(diǎn)，廣泛存在于GLUT蛋白家族中[1].肌肉及脂肪組織中的葡萄糖攝取主要依賴于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4 (GLUT4)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞外的葡萄糖通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞.GLUT4對(duì)維持體內(nèi)糖平衡及穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，GLUT4在肌肉或脂肪組織中表達(dá)的選擇性中斷會(huì)誘導(dǎo)全身的胰島素抵抗.

A549細(xì)胞是一種人肺腺癌上皮細(xì)胞系.它在形態(tài)、結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物組成上與II型肺泡細(xì)胞極為相似，后者是一類直徑約9 μm的球形肺泡細(xì)胞，主要合成和分泌脂蛋白類物質(zhì)，穩(wěn)定肺泡體積變化，降低其表面張力，其功能異?？赡軙?huì)引起水腫的發(fā)生.因此，A549細(xì)胞已被用作研究II型肺泡細(xì)胞反應(yīng)的模型[2].另一方面，它作為非小細(xì)胞肺癌中的一種，在肺癌研究中具有一定的意義.癌細(xì)胞具有不受控的無限增殖及持續(xù)的侵襲與遷移的能力，發(fā)生比正常細(xì)胞更多的能量代謝及糖代謝，GLUT4作為葡萄糖傳感器和治療糖尿病的重要靶點(diǎn)，在癌細(xì)胞中的作用機(jī)制鮮有報(bào)道，因此構(gòu)建GLUT4基因敲減的A549細(xì)胞系，探討GLUT4基因表達(dá)缺失是否會(huì)對(duì)A549細(xì)胞葡糖糖攝取及細(xì)胞功能上產(chǎn)生影響很有意義.

CRISPR/Cas9是近年來在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種免疫系統(tǒng)，原本是一種存在于古細(xì)菌和細(xì)菌中的規(guī)律、成簇的間隔短回文重復(fù)序列，為自身提供特異性保護(hù)機(jī)制[3].它在各種模式生物以及人類細(xì)胞[4]中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的基因編輯活性.后對(duì)真核細(xì)胞中的這種新型CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行改造，如對(duì)Cas9內(nèi)切酶進(jìn)行了優(yōu)化，使其包括人類細(xì)胞的核定位信號(hào)，并可合成單個(gè)引導(dǎo)RNA(sgRNA)，以針對(duì)任何20 bp的DNA序列[5]，從而達(dá)到定點(diǎn)基因編輯的目的.

我在新西蘭做獲獎(jiǎng)演說時(shí)，我講過“文學(xué)是另一種造屋”。寫作就是造屋，第一個(gè)層面的造屋是使人們有個(gè)安居的地方，讓心靈有一個(gè)安頓的地方，作品就是心靈的屋子；第二個(gè)層面的造屋是指每個(gè)人都向往自由，自由在哪里能實(shí)現(xiàn)？是在文學(xué)的這個(gè)屋子里實(shí)現(xiàn)，因?yàn)檫@個(gè)屋子是我的，我可以在這個(gè)地方自由地放飛我的思想。從這個(gè)意義上講，你想得到的自由，寫作可以滿足你。

基于CRISPR/Cas9技術(shù)，本文擬構(gòu)建GLUT4敲減細(xì)胞系，從而對(duì)該基因在肺癌細(xì)胞中的功能進(jìn)一步研究.

在NCBI網(wǎng)站上查找并設(shè)計(jì)人源GLUT4基因的Real-time PCR引物，找出一組評(píng)分最高的引物進(jìn)行合成.引物序列見表2.利用Trizol提取總RNA，而后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用普通PCR檢測(cè)GLUT4基因的Real-time PCR引物是否可用，若GLUT4和β-actin均有條帶，則此GLUT4引物設(shè)計(jì)成功，可供后續(xù)使用，反之，則需重新設(shè)計(jì)引物.

1.2.6 培訓(xùn)設(shè)施 Laerdal211—00050SinMan高級(jí)全功能綜合模擬人心肺復(fù)蘇聽診與腹部觸診仿真電子標(biāo)準(zhǔn)化病人TV8021M3BW44llg心肺音聽診模型、高級(jí)綜合穿刺術(shù)與叩診檢查技能訓(xùn)練模擬人MWA496028、3BW44008外科縫合包扎展示模型、高級(jí)外科縫合腿肢模型RLDO76O02、無菌技術(shù)操作包、換藥操作包、小型綜合手術(shù)技巧訓(xùn)練模塊、針灸針、火罐、針包、電針、聽診器、叩診錘、直尺、皮尺等。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

A549肺癌細(xì)胞(Procell)；Fast DigestBpiI、Fast AP、10X Fast Digest Buffer(Thermo Scientific)；Stbl3感受態(tài)大腸桿菌、10X T4 Ligation Buffer、T4 DNA ligase(武漢淼靈生物)；T4 PNK、10XTaq Buffer、dNTP、rTaq(TaKaRa)；PX458質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific)；Protein Ladder(Thermo)；DTT(Biosharp)；PMSF、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、膠回收試劑盒(AxyGen)；BeyoECL Plus、Tween-20、上樣緩沖液(碧云天)；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)；Lipofectamine 3000 (Invitrogen)；甲醇(分析醇)；氯化鈉、甘氨酸、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈣(國(guó)藥集團(tuán))；Anti-β-actin、HRP-goat anti mouse IgG(康為世紀(jì))；引物合成、引物合成及基因測(cè)序(武漢擎科生物)；Anti-GLUT4(Cell Signaling Technology).

核酸凝膠成像系統(tǒng)、蛋白凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD, USA)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán))；流式細(xì)胞儀(BD公司)；DYY-6C 型電泳儀(北京六一儀器)；冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；酶標(biāo)儀(Infinite200型，TECAN) ; Real-Time PCR System(7500fast型，Applied Biosystems).

1.2 sgRNA序列的設(shè)計(jì)

在NCBI上檢索出人源GLUT4基因的mRNA序列，將位于CDS區(qū)的靠前的幾個(gè)外顯子序列依次粘貼至CRISPR在線設(shè)計(jì)工具網(wǎng)站http://crispr.mit.edu/，選擇評(píng)分最高的sgRNA，根據(jù)PX458載體上BpiI限制酶的酶切位點(diǎn)，在選定的sgRNA序列5′端添加CACCG，對(duì)應(yīng)互補(bǔ)鏈的3′端加上C，5′端加上AAAC，設(shè)計(jì)出的四個(gè)成對(duì)的sgRNA序列見表1，PX458質(zhì)粒圖譜見網(wǎng)站http://www.addgene.org/48138/.

表1 GLUT4 sgRNA引物名稱及序列Tab.1 Primename and sequences of GLUT4 sgRNA

1.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與檢測(cè)

利用快切酶BpiI對(duì)PX458質(zhì)粒的Bbsi位點(diǎn)進(jìn)行特異性切割，跑膠鑒定后得到線性質(zhì)粒，同時(shí)將成對(duì)的sgRNA退火成雙鏈，切膠回收后的線性質(zhì)粒及稀釋后的sgRNA雙鏈在T4 DNA ligase 的作用下進(jìn)行連接[6]，而后通過45 s熱擊轉(zhuǎn)化至stbl3感受態(tài)中，37 ℃過夜培養(yǎng)，將長(zhǎng)出來的菌落挑選出一部分，150 r·min-1搖菌，部分保種，而后送測(cè)序以鑒定是否構(gòu)載成功.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)約兩周后將細(xì)胞轉(zhuǎn)至24孔板里，等到細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%再將細(xì)胞轉(zhuǎn)入12孔板中.待到12孔板里細(xì)胞長(zhǎng)滿，抽提各孔細(xì)胞基因組，做好標(biāo)記送測(cè)，而后與原始序列進(jìn)行比對(duì)，從而挑選出被編輯的細(xì)胞株，擴(kuò)培后一部分凍存，一部分開展后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.5 流式細(xì)胞儀分選

采用Origin 9.0和 CorelDRAW X4 SP2繪圖，采用t-test 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù).

1.6 基因組提取及測(cè)序

A549細(xì)胞用含1%雙抗、10%胎牛血清和89% RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)液培養(yǎng)在含5%的CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中.待細(xì)胞狀態(tài)生長(zhǎng)良好，使用Lip 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按說明書進(jìn)行操作.將細(xì)胞傳代至六孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%的匯合率進(jìn)行實(shí)驗(yàn).先使用opti-MEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞，再配制125 μL opti-MEM、2.5 μg質(zhì)粒和5 μL P3000的混合液，以及125 μL opti-MEM、3.75 μL Lipo-3000的混合液，分別靜置5 min后，輕輕混勻.再靜置5 min后，加入細(xì)胞中，3 h后換RPMI培養(yǎng)基，24 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞發(fā)出熒光的狀態(tài).

1.7 Real-time PCR檢測(cè)mRNA水平敲減效率

第一，把好選苗關(guān)。種龜試蛋產(chǎn)出的苗和病龜產(chǎn)蛋孵化出的龜苗都會(huì)出現(xiàn)體質(zhì)較弱的特點(diǎn)，在飼養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)問題；年輕種龜苗抗病能力低，老種龜苗為上選；最傻瓜的方法：買大不買小，還要搞清楚是自然孵化出的還是加溫孵化出的，前者抗病能力強(qiáng)。

取八連排離心管，按照如下體系配好(5×Real-time PCR mix 10 μL，Primer-R 1 μL，Primer-F 1 μL，Template 7 μL，H2O 20 μL)，放入Real-time PCR儀中，得到所測(cè)量的數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

表2 Real-time PCR引物列表Tab.2 Real-time PCR primer list

1.8 Western Blot檢測(cè)蛋白水平敲減效率

待野生型A549細(xì)胞株與GLUT4基因敲減細(xì)胞株生長(zhǎng)達(dá)到90%的匯合率時(shí)，提取細(xì)胞總蛋白，用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配完膠后，點(diǎn)樣，濃縮膠80 V/40 min，分離膠100 V /1.5 h，后在100 V電壓下轉(zhuǎn)膜1 h，置于5% BSA溶液中封閉1 h，敷一抗過夜，每10 min 用PBST洗膜，3次后敷二抗1 h，最后再3次PBST及2次PBS清洗后，通過ECL顯影觀察條帶，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.9 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)葡萄糖攝取水平變化

待野生株與突變株細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用胰酶消化下來，用1 mL培養(yǎng)液富集消化的細(xì)胞，棄850 mL的細(xì)胞懸液，留150 mL的細(xì)胞懸液備用.在剩余的150 mL溶液中加入3 mL的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋.用鑷子將浸泡在酒精中備用的載玻片取出，放在酒精燈上烘干，放置在玻璃培養(yǎng)皿的中央，取1 mL的稀釋過后的培養(yǎng)液，在載玻片的中央緩慢的將培養(yǎng)液加入到載玻片上，每一株細(xì)胞做3組平行.待細(xì)胞生長(zhǎng)至16 h時(shí)，用5 mL PBS沖洗載玻片， 10 mL PSS溶液饑餓細(xì)胞2 h，再將載玻片安置于載物臺(tái)上，加入200 μL 濃度為100 mM的2-NBDG熒光染料，暗處孵育1 h.使用Confocal顯微鏡觀察并圈取60株細(xì)胞記錄細(xì)胞,熒光量并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

《村民委員會(huì)組織法》中沒有規(guī)定具體的監(jiān)督操作流程。由于集體經(jīng)濟(jì)組織資源，尤其是土地資源非常稀缺，如果仿照公司結(jié)構(gòu)模式運(yùn)行，那么必須設(shè)置監(jiān)督委員會(huì)，否則村民利益會(huì)經(jīng)常受到侵害。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后，用胰酶將其消化下來，用含1% FBS的PBS重懸細(xì)胞，再將其濾過300目流式膜并收集于已滅菌的流式管中，以轉(zhuǎn)入空載的細(xì)胞作為對(duì)照調(diào)節(jié)電壓等參數(shù)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，而后將單個(gè)的轉(zhuǎn)染后發(fā)綠色熒光的細(xì)胞分別打到每個(gè)孔事先加入了200 μL的含20%的血清和2%雙抗的培養(yǎng)基的96孔板中.

高度集成化的E-HOUSE功能，使其優(yōu)于傳統(tǒng)的土建式電氣室，既降低了成套設(shè)備對(duì)現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境、對(duì)土建施工與設(shè)備配套的要求，又縮短了現(xiàn)場(chǎng)設(shè)備集成和調(diào)試的工期。同時(shí)，其靈活的拆裝性能更方便于日后的站內(nèi)改造工程，可以根據(jù)需要改變其位置，僅需重新施工基礎(chǔ)即可。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

將標(biāo)記好的各株單克隆細(xì)胞抽提基因組測(cè)序后，與GLUT4基因原始序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖2顯示，只有3-6對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的編輯，峰圖也可見明顯的套峰.

a,c)明場(chǎng)下視野(10×)；b,d)熒光下視野(10×)圖1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞Fig.1 A549 cells transfected by plasmid

2.2 構(gòu)建敲減GLUT4基因的A549細(xì)胞株

利用lipo3000將測(cè)序比對(duì)后構(gòu)建成功的重組載體PX458-sgRNAS1、S2、S3、S4分別轉(zhuǎn)進(jìn)A549細(xì)胞里，24 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，如圖1所示，由綠色熒光細(xì)胞分布密度可反映空載及重組載體均以較高效率成功轉(zhuǎn)入到A549細(xì)胞中.

圖2 PX458-sgRNA-S1的序列比對(duì)及峰圖Fig.2 Sequence alignment and peak map of PX458-sgRNA-S1

2.3 Real-time PCR檢測(cè)表明突變株GLUT4基因mRNA表達(dá)量顯著降低

首先，我們根據(jù)他電話中提供的個(gè)人信息，核實(shí)了他是本單位在冊(cè)在崗員工，查詢到了他所在的作業(yè)單元。緊接著，我們聯(lián)系了具體負(fù)責(zé)該項(xiàng)事務(wù)的勞資員，說明了有關(guān)情況。負(fù)責(zé)他所在作業(yè)單元?jiǎng)谫Y工作的員工雖顯緊張，但積極且迅速地配合了我們的工作。她先查詢了她負(fù)責(zé)的工資表情況，核實(shí)無誤，又致電了對(duì)接其工作的財(cái)務(wù)人員，確認(rèn)工資已上賬，便立馬將情況反饋給我們。

對(duì)野生株和突變株這兩株細(xì)胞中的GLUT4基因的mRNA的表達(dá)含量進(jìn)行了檢測(cè)(圖3)，這是對(duì)基因敲減效果的初步鑒定，由mRNA表達(dá)含量的減少可知基因敲減作用十分明顯，圖3中與野生株相比，3-6的GLUT4基因的mRNA表達(dá)量減少了約75%，結(jié)果由3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得，可進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的鑒定.

狗子還不肯離開。雪螢想了想，掏出50元錢遞給他，“去，買糖吃，錢沒花完不準(zhǔn)回來找阿姨?！惫纷痈吲d得跳了起來，抓過錢跑下了樓。

圖3 Real-time PCR檢測(cè)突變株GLUT4基因的mRNA表達(dá)量Fig.3 Detection of GLUT4 gene mRNA expression by Real-time PCR

2.4 Western blot檢測(cè)表明突變株細(xì)胞GLUT4蛋白表達(dá)水平降低

將篩選出來的被編輯的突變株細(xì)胞提蛋白后，與野生型A549細(xì)胞做對(duì)比，檢測(cè)其蛋白水平表達(dá)的變化，結(jié)果如圖4，統(tǒng)計(jì)圖由3次重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得.由圖4可知：3-6細(xì)胞GLUT4蛋白的表達(dá)減少了85%，證明已經(jīng)成功的獲得了GLUT4基因敲減的A549細(xì)胞株.

圖4 Western blot 檢測(cè)3-6與WT的蛋白表達(dá)差異Fig.4 Difference of protein expression between 3-6 and WT detected by Western blot

2.5 GLUT4敲減細(xì)胞株的葡萄糖攝取水平顯著降低

使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)貼片培養(yǎng)并孵育1 h 熒光染料2-NBDG的野生型A549細(xì)胞和突變型細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖攝取水平測(cè)定，并分別圈取視野下的60株細(xì)胞，對(duì)其熒光強(qiáng)度取均值，再用t檢驗(yàn)比較兩組間的差異性，對(duì)應(yīng)的顯微觀測(cè)圖以及熒光強(qiáng)度情況見圖5.從圖5可見：3-6細(xì)胞的熒光強(qiáng)度弱于野生型A549細(xì)胞，3-6細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度為5.6958，野生型A549細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度為9.55845，即3-6細(xì)胞的葡萄糖攝取量低于野生型A549細(xì)胞.

圖5 激光共聚焦顯微術(shù)檢測(cè)葡萄糖攝取量Fig.5 Glucose uptake detected by Confocal

3 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)是近些年快速發(fā)展起來的基因編輯技術(shù).在此之前，鋅指核酸酶(ZFN)和TALEN技術(shù)分別占據(jù)了基因編輯技術(shù)的半壁江山.這兩種基因敲除的方法主要是通過在DNA靶位點(diǎn)或者附近產(chǎn)生雙鏈斷裂之后，通過DNA的非同源性修復(fù)雙鏈斷裂來完成的[7,8].上述兩種基因敲除的方法雖然成熟，但是步驟復(fù)雜，且基因敲除體系太大.然而CRISPR/Cas9則是針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)特異性的sgRNA，后利用Cas9蛋白對(duì)靶序列進(jìn)行切割從而達(dá)到編輯基因的目的[9]，具有更低的成本、更簡(jiǎn)單的操作方法和更高效的編輯效率等優(yōu)點(diǎn).

GLUT4在調(diào)節(jié)全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[10].研究表明，大網(wǎng)膜脂肪組織中GLUT4的表達(dá)量可能會(huì)成為結(jié)直腸癌診斷的有利生物標(biāo)志物和預(yù)測(cè)靶點(diǎn)[11].結(jié)腸癌患者NK細(xì)胞中GLUT4表達(dá)量的減少是引起這些細(xì)胞功能失活的關(guān)鍵原因[12].GLUT4的缺失會(huì)損害乳腺癌細(xì)胞的增殖，并在低氧條件下嚴(yán)重影響細(xì)胞活力[13].另外，開發(fā)GLUT4選擇性抑制劑可作為抗癌治療藥物[14]，一些能夠通過抑制GLUT4蛋白來調(diào)節(jié)癌細(xì)胞葡萄糖消耗的植物化學(xué)物質(zhì)也漸漸被研究去作為新的治療癌癥的治療候選藥物.為了確定GLUT4對(duì)肺癌細(xì)胞正常代謝生理的作用，本文選擇A549肺癌細(xì)胞來開展研究.先成功構(gòu)建了pX458-sgRNA表達(dá)載體，篩選得到了一株編輯情況最好的突變株細(xì)胞3-6，對(duì)其mRNA表達(dá)量和蛋白質(zhì)表達(dá)含量的測(cè)定均檢驗(yàn)到了較大程度的敲減效果，3-6細(xì)胞株mRNA表達(dá)量減少了約83%，GLUT4蛋白表達(dá)量減少約85%.GLUT4基因敲減的3-6突變細(xì)胞株所發(fā)出的熒光沒有野生型A549細(xì)胞的熒光強(qiáng)，說明3-6細(xì)胞的葡萄糖攝取量比正常的A549細(xì)胞低很多.實(shí)驗(yàn)證明：GLUT4基因的敲減對(duì)于A549細(xì)胞中GLUT4基因mRNA及蛋白的表達(dá)量產(chǎn)生了明顯的表型影響，并且敲減后的突變細(xì)胞株在葡萄糖攝取水平上發(fā)生了明顯的降低，這對(duì)肺癌及哮喘的研究開辟了新的方向，通過抑制葡萄糖的攝取，來降低細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)肺部和氣管細(xì)胞的作用.

綜上所述，本文構(gòu)建了GLUT4基因敲減的細(xì)胞系，為其在肺癌細(xì)胞中基因功能研究提供了工具和方法，為后續(xù)深入研究其對(duì)肺癌細(xì)胞功能的影響奠定了基礎(chǔ).