張娟　方祥位　劉漢龍　肖楊　張楠　曹小方

摘 要：為了為汽油污染土的微生物修復(fù)提供優(yōu)良菌種，以LB培養(yǎng)基為基質(zhì)，從石油污染土中對汽油降解菌進行了分離鑒定，以降油培養(yǎng)基為基質(zhì)對分離得到的菌株進行汽油降解率的測定，以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值及培養(yǎng)時間為參數(shù)對5種具有優(yōu)良汽油降解性能的菌株進行單因素試驗，基于單因素試驗結(jié)果進行三因素三水平的正交試驗后，以汽油降解率為響應(yīng)值對試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，篩選出具有優(yōu)良降解性能的菌株，并確定了菌株降解汽油的最佳條件。結(jié)果表明：從石油污染土中分離出了9種具有汽油降解性能的菌株，其中，銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌屬以及戈登氏菌屬具有優(yōu)良降解性能，這5種菌降解汽油的最優(yōu)條件為：銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌以及戈登氏菌的最佳培養(yǎng)溫度均為32 ℃，培養(yǎng)基pH值均為7.0，培養(yǎng)時間均為20 h，降油培養(yǎng)基中的汽油降解率分別為70.12%、76.42%、75.66%、77.50%和73.22%。

關(guān)鍵詞：石油污染土;汽油降解率;微生物;正交試驗;污染土修復(fù)

中圖分類號：X53 文獻標志碼：A 文章編號：2096-6717（2020）01-0144-09

Abstract：In order to provide excellent strains for microbial remediation of gasoline-contaminated soil， the gasoline-degrading bacteria were isolated and identified from petroleum-contaminated soil using LB medium as the substrate， and the gasoline degradation rate was determined by using the oil-reducing medium as the substrate. Single factor test was carried out on five strains with excellent gasoline degradation performance at culture temperature， medium pH and culture time. Based on the single factor test results， three factors and three levels of orthogonal test were carried out to degrade with gasoline. Response surface analysis of test results with gasoline degradation rate response， screening of strains with excellent degradation performance and determining the optimal conditions for the degradation of gasoline by the strain. The results showed that nine strains with gasoline degradation properties were isolated from petroleum contaminated soil. Among which Pseudomonas aeruginosa， Pseudomonas， Pleurobacter， Bordetella and Goldenella had excellent degradation performance. The optimal conditions for determining the degradation of gasoline by these five kinds of bacteria as follows： The optimum culture temperature for Pseudomonas aeruginosa， Pseudomonas， Pleurobacter， Bordetella and Gordonia is 32℃，the pH of the medium is 7.0 and the culture time is 20 h. The degradation rates of gasoline in the oil-reducing medium are 70.12%， 76.42%， 75.66%， 77.50% and 73.22%， respectively.

Keywords：petroleum contaminated soil; gasoline degradation rate; microorganisms; orthogonal test; remediation of contaminated soil

石油是一種重要的能源，對經(jīng)濟和人民的生活水平都有很大的推動作用，但在石油的開采、加工以及運輸過程中會發(fā)生石油泄漏等問題，資料表明，中國目前直接進入到環(huán)境中的石油約有6×105 t，對土壤以及地下水造成嚴重污染。而汽油是用量最大的輕質(zhì)石油產(chǎn)品之一，汽油物質(zhì)進入土壤后，主要從兩個方面對土壤的理化性質(zhì)造成影響：一是會影響土壤的通透性，使得土壤的結(jié)構(gòu)遭到破壞[1];二是汽油中的反應(yīng)基能夠與土壤中的無機氮和磷結(jié)合并限制土壤的硝化作用和脫磷酸作用，導(dǎo)致土壤中有機質(zhì)的碳氮比和碳磷比增大[2-4]。此外，汽油中的某些烴類具有致病變、致癌甚至致畸形的作用，通過污染土進入人體后，大量積累會嚴重危害到人體的健康[5]。因此，汽油污染土的治理和修復(fù)一直受到高度重視。

傳統(tǒng)的污染土治理方法有物理法和化學(xué)法，物理修復(fù)法主要有挖掘填埋法、電解法、洗滌法和氣體吹脫法等，但物理法所用的設(shè)備價格昂貴且可能破壞土壤的結(jié)構(gòu)和組分?；瘜W(xué)法主包括氧化劑氧化法、萃取法、熱分解法和光化學(xué)氧化法等，主要技術(shù)是利用化學(xué)浸出進行除油，但此方法有可能對土體造成二次污染[6]。

生物修復(fù)法是一種綠色節(jié)能的方法，主要利用微生物及其他生物，將土壤中的有毒烴類污染物降解為二氧化碳和水等無毒無害物質(zhì)，從而達到修復(fù)土壤的目的[7]。研究發(fā)現(xiàn)，有大量微生物能夠以石油中的烴類作為唯一碳源進行繁殖生長，微生物繁殖較快且比表面積大，因此，微生物修復(fù)污染土成為研究熱點[8]。目前，關(guān)于原油生物降解的研究主要集中在降解菌的篩選與鑒定[9-10]和生物降解機理[11-12]。閆志宇等[13]分離篩選出的菌株Bacillus subtilus L3能高效降解乙草胺。Guo等[14]從柴油污染的土壤中分離出兩種耐寒的石油烴降解菌株CHD1和CHD2。而汽油作為用量最大的石油提取物，對土壤造成的污染也最多。

已有研究表明，多種微生物都能對汽油烴類物質(zhì)進行降解，但降解能力存在較大差異，因此，篩選降解汽油烴能力較強的菌種將會大大提高污染土的修復(fù)效率[15]。筆者通過從石油污染土中的微生物進行分離鑒定以及通過正交試驗和響應(yīng)面分析對其降解汽油性能進行測定和優(yōu)化，從而為汽油污染土的生物修復(fù)法提供優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

石油污染土來源于甘肅省成縣油氣管道轉(zhuǎn)換站，圖1所示為采集的土樣。主要取自表層以下2～15 cm處的污染土。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母浸出粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L，配制200 mL，pH值調(diào)節(jié)為7.0，121 ℃滅菌20 min。

降油培養(yǎng)基：NaCl 10 g，NH4Cl 0.50 g，KH2PO4 0.50 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO4 0.50 g，CaCl2 0.1 g，KCl 0.10 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL，95號汽油4 g，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的分離與鑒定 稱取石油污染土1.0 g放入到裝有9.0 mL的無菌生理鹽水的試管內(nèi)，在漩渦混合器中充分混勻，此時，溶液的稀釋度為10-1。利用梯度稀釋法對其繼續(xù)進行稀釋，稀釋的梯度分別為10-2、10-3、10-4和10-5。用移液器從10-3、10-4和10-5這3個梯度中吸取20 μL的稀釋液，然后，在超凈工作臺內(nèi)將其接種到滅菌過的LB培養(yǎng)基中進行涂布，涂布均勻后，將培養(yǎng)基放入32 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)24 h[16-17]。培養(yǎng)完成后，觀察并記錄菌落形態(tài)，挑取不同形態(tài)的單菌落接種到固體培養(yǎng)基中，重復(fù)多次。對菌種進行純化后，分別進行生理生化實驗，然后，將純化后的菌株接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，保存于4 ℃的冰箱內(nèi)。對每個菌種的DNA進行提取[4，18-19]，利用細菌的通用引物進行PCR擴增，得到約1 500 bp條帶后，通過Sanger法進行測序（擎科興業(yè)生物有限公司完成），將得到的序列利用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比對，從而確定菌株的類別。

1.3.2 優(yōu)良降解菌株的篩選 將純化后的菌種在超凈工作臺內(nèi)接種到200 mL的LB液體培養(yǎng)基中，然后置于32 ℃、180 r/min的搖床內(nèi)進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，測定菌液在600 nm處的吸光度。吸取2 mL菌液，接種到200 mL的降油培養(yǎng)基內(nèi)，同樣在32 ℃、180 r/min的搖床內(nèi)進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)2、4、6 d后，分別對培養(yǎng)基內(nèi)的汽油含量進行測定，并計算最終的汽油降解率。每個菌種做3組平行試驗，結(jié)果取平均值，從而對具有高效汽油降解能力的菌種進行篩選。

1.3.3 汽油降解率的測定方法 將降解后的培養(yǎng)液放入離心機內(nèi)離心（轉(zhuǎn)速為100 r/min），20 min后提取上清液到新的滅菌過的錐形瓶內(nèi)，每1 L上清液加入5 mL硫酸進行酸化，然后加入40 mL的石油醚，將培養(yǎng)基內(nèi)殘余的汽油提取后對其質(zhì)量進行測定，汽油降解率的計算式為[20]

1.3.4 菌種降解性能的測定

1）單因素試驗 以LB培養(yǎng)基作為基質(zhì)，按照表1的3組實驗方案進行菌種的培養(yǎng)，培養(yǎng)20 h后，吸取20 μL菌液加入到降油培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)6 d后，對培養(yǎng)基中殘余汽油含量進行測定，計算并記錄汽油降解率。

2）在單因素試驗的結(jié)果之上，對具有高效汽油降解能力的菌種進行三因素三水平的正交實驗，然后按照實驗方案所列的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)[3，21]。利用Design-expert軟件對實驗結(jié)果進行分析以及最優(yōu)求解從而確定菌種降解汽油的最佳培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 汽油降解菌的分離與鑒定

從汽油污染土中共分離出9株菌株，除了菌1和菌5形態(tài)特征較為明顯之外，其余在平板上的特征較為相似。將這9種菌株進行編號為菌1～菌9，并對其進行形態(tài)學(xué)觀察，這9種菌上的特點見圖2。

對每種菌進行分離純化后進行生理生化實驗，結(jié)果如表2所示。

利用NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中的Blast對測序結(jié)果和己知序列進行比對，分析其相似度，具體的鑒定結(jié)果為：菌1為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），菌2為假單胞菌屬（Pseudomonas），菌3為蒼白桿菌屬（Pleurobacter），菌4為博得特氏菌屬（Bordetella），菌5為戈登氏菌屬（Gordonia），菌6為同溫層芽孢桿菌（Bacillus），菌7為洛菲不動桿菌（Acinetobacter），菌8為瓊氏不動桿菌（Acinetobacter junii），菌9為暹羅芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），且相似率均大于99.9%。

2.2 優(yōu)良降解菌的篩選

對9株菌在降油培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)6 d后的汽油降解率進行測定，結(jié)果見表3。

根據(jù)表3可知，菌1、2、3、4、5的汽油降解率均超過60%，證明菌1、2、3、4、5降解汽油的能力較好，即銅綠假單胞菌、假單胞菌菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌屬以及戈登氏菌屬對汽油有著較好的降解能力，且這5種菌無致病性，對環(huán)境無污染性。

2.3 菌株降解性能的測定

2.3.1 單因素試驗結(jié)果 培養(yǎng)溫度對5種菌的汽油降解率的影響如圖3所示。由圖3可知，培養(yǎng)溫度對5種菌的汽油降解率的影響趨勢大致相同，當溫度小于35 ℃時，隨著培養(yǎng)溫度的升高，汽油降解率呈現(xiàn)上升趨勢，當溫度大于35 ℃，汽油降解開始下降，對于這5種菌來說，35 ℃是較為合適的培養(yǎng)溫度。

培養(yǎng)基的pH值對5種菌的汽油降解率的影響如圖4所示。由圖4可知，培養(yǎng)基pH值對5種菌的汽油降解率的影響趨勢大致相同，除了菌4在培養(yǎng)基pH為7.5時汽油降解率達到最大值，其余4種菌均在培養(yǎng)基pH為7時，汽油降解率達到最大值。

培養(yǎng)時間對5種菌汽油降解率的影響如圖5所示。由圖5可知，菌1在培養(yǎng)24 h時汽油降解率達到最大值，超過24 h后開始下降，菌1在20、24 h的汽油降解率較為穩(wěn)定，但超過24 h后開始下降，其余3種菌的汽油降解率均在培養(yǎng)20 h時達到最大值。

2.3.2 正交實驗結(jié)果 基于單因素試驗結(jié)果確定的正交實驗的因素和水平如表4所示。

根據(jù)設(shè)計的正交實驗方案進行實驗后，對每組的殘余汽油量進行測定后對汽油降解率進行計算，得到的正交實驗結(jié)果如表5所示。

將實驗數(shù)據(jù)錄入軟件進行分析，菌1～菌5的正交實驗結(jié)果的方差分析如表6～表10所示。

由表6～表10可知，這5個模型的F值分別為91.75、2 042.52、14 452.75、1 091.50以及79 620.51，且P值都小于0.000 1，說明這5個模型的回歸方程極顯著，且這5個模型的失擬項都不顯著，說明這5個模型都具有較好的模擬性，因此，這5個模型可以對石油降解率進行分析和預(yù)測。

F值的大小反映出因素對實驗因變量的影響程度，F(xiàn)值越大，表示因素對實驗因變量的影響越顯著。由表6可知，對菌1的汽油降解率影響大小的因素依次是：因素A>因素C>因素B（培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時間>培養(yǎng)基pH值）;由表7可知，對菌2的汽油降解率的影響大小的因素依次為：因素B>因素C>因素A（培養(yǎng)基pH值>培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度）;由表8可知，對菌3的汽油降解率影響大小的因素依次為：因素C>因素A>因素B（培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)基pH值）;由表9可知，對菌4的汽油降解率影響大小的因素依次為：因素B>因素A>因素C（培養(yǎng)基pH值>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時間）;由表10可知，對菌5的汽油降解率影響大小的因素依次為：因素C>因素A>因素B（培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)基pH值）。

利用Design-Expert 8.0.6軟件聯(lián)合求解這5個模型，得到結(jié)果為：菌1的最佳培養(yǎng)溫度為32.14 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為7.00，最佳培養(yǎng)時間為20.12 h，在此條件下算出的石油降解率為70.167 4%;菌2的最佳培養(yǎng)溫度為32.00 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為7.01，最佳的培養(yǎng)時間為20.07 h，在此條件下算出的汽油降解率為76.416 8%;菌3的最佳培養(yǎng)溫度為32.03 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為7.00，最佳培養(yǎng)時間為20.05 h，在此條件下算出的汽油降解率為75.676 6%;菌4的最佳培養(yǎng)溫度為31.84 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為6.97，最佳培養(yǎng)時間為19.84 h，在此條件下算出的汽油降解率為77.524 6%;菌5的最佳培養(yǎng)溫度為32.02 ℃，培養(yǎng)基的最佳pH值為7.00，最佳的培養(yǎng)時間為20.06 h，在此條件下算出的汽油降解率為73.250 6%。

由于這些最佳條件的參數(shù)在實際操作水平中很難實現(xiàn)，考慮到因素對于結(jié)果的影響大小，做以下調(diào)整：將菌1的培養(yǎng)溫度調(diào)整為32.1 ℃，培養(yǎng)時間調(diào)整為20 h，在此條件下再次進行實驗得到的汽油降解率為70.17%;將菌2的培養(yǎng)基pH值調(diào)整為7，培養(yǎng)時間為20 h，在此條件下進行實驗得到的汽油降解率為76.42%;將菌3的培養(yǎng)溫度調(diào)整為32.0 ℃，培養(yǎng)時間為20 h，在此條件下進行實驗得到的汽油降解率為75.66%;將菌4的培養(yǎng)溫度調(diào)整為31.8 ℃，培養(yǎng)基pH值調(diào)整為7.0，培養(yǎng)時間為20 h，在此條件下進行實驗得到的汽油降解率為77.50%;將菌5的培養(yǎng)溫度調(diào)整為32 ℃，培養(yǎng)時間為20 h，在此條件下進行實驗得到的汽油降解率為73.22%。

3 結(jié)論

1）從石油污染土中分離出的9種菌分別為：銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌屬、戈登氏菌屬、同溫層芽孢桿菌、洛菲不動桿菌、瓊氏不動桿菌以及暹羅芽孢桿菌，均對汽油具有一定的降解能力。

2）篩選出的高效汽油降解能力的5種菌為銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌屬以及戈登氏菌屬，5種菌的汽油降解率均超過60%。

3）5種具有較高汽油降解能力的菌降解汽油的最佳培養(yǎng)條件分別為：假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、戈登氏菌屬、銅綠假單胞菌以及博得特氏菌屬的最佳培養(yǎng)溫度均為32 ℃;培養(yǎng)基pH值均為7.0;培養(yǎng)時間均為20 h。銅綠假單胞菌、假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博得特氏菌以及戈登氏菌的汽油降解率分別為70.12%、76.42%、75.66%、77.50%和73.22%，且這5種菌對人體沒有致病性，也不會對環(huán)境造成污染，可為污染土的生物修復(fù)提供優(yōu)良菌種。

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（編輯 王秀玲）