張?jiān)丛? 濮壽琴 胡彥師 方家林 黃肖 李維國(guó) 黃華孫

摘? 要：倍性鑒定是橡膠樹(shù)種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)工作之一。本研究利用流式細(xì)胞儀對(duì)國(guó)家橡膠樹(shù)種質(zhì)資源圃?xún)?nèi)的橡膠樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行全面的倍性鑒定，對(duì)嵌合體的四倍體細(xì)胞比例進(jìn)行分析，并比較不同倍性的氣孔性狀差異。從5177份野生種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)三倍體11份，四倍體1份。從552份魏克漢種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，三倍體9份，四倍體2份，嵌合體14份。14份嵌合體的四倍體細(xì)胞比例在49.06%～78.26%之間。不同倍性間的氣孔長(zhǎng)度、寬度和密度差異均極顯著，氣孔長(zhǎng)度和寬度的排序?yàn)樗谋扼w>三倍體>嵌合體，氣孔密度的排序相反。研究結(jié)果對(duì)利用四倍體種質(zhì)資源開(kāi)展橡膠樹(shù)倍性間雜交育種具有重要應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：橡膠樹(shù);種質(zhì)資源;多倍體;流式細(xì)胞儀;氣孔性狀

中圖分類(lèi)號(hào)：Q949.748.5? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Ploidy Identification of Germplasm Resources in Hevea brasiliensis （Willd. ex A. Juss.） Müll. Arg.

ZHANG Yuanyuan1，2，3，4，5， PU Shouqin6，7*， HU Yanshi1，2，3，4，5， FANG Jialin1，2，3，4，5， HUANG Xiao1，2，3，4，5，

LI Weiguo1，2，3，4，5**， HUANG Huasun1，2，3，4，5

1. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 2. State Centre for Rubber Breeding， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Rubber Tree Germplasm Repository， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 4. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 5. State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China; 6. College of Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 7. Engineering Research Center of Rare and Precious Tree Species in Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： Ploidy of rubber tree germplasm in the Rubber Tree Germplasm Repository and the ratio of tetraploid cells in chimeras were analyzed by flow cytometry， and the stomatal traits of different ploidy were analyzed. Eleven triploids and one tetraploid were found from 5177 1981IRRDB germplasms， nine triploids and two tetraploid and fourteen chimeras were found from 552 Wickham germplasms. The ratio of tetraploid cells in fourteen chimeras ranged from 49.06% to 78.26%. The difference of stomatal length， stomatal width， and stomatal density between different ploidy was significant （P<0.01）， the rank of stomatal length and stomatal width was tetraploid>triploid>chimeras， while the stomatal density was reversed. This study was valuable for the use of tetraploid germplasm resources for cross breeding between the ploidy of rubber trees.

Keywords： Hevea brasiliensis; germplasm resources; polyploid; flow cytometry; stomatal traits

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.006

橡膠樹(shù)原生于南美洲亞馬遜熱帶雨林地區(qū)，屬大戟科（Euphorbiaceae）橡膠屬（Hevea）植物。自19世紀(jì)80年代引種到東南亞地區(qū)以來(lái)，經(jīng)過(guò)育種家不斷地選擇育種，產(chǎn)量從初生代無(wú)性系的300～400 kg/（hm2·a）增長(zhǎng)到如今的2000～ 3500 kg/（hm2·a） [1]。長(zhǎng)期的選擇育種導(dǎo)致當(dāng)前橡膠樹(shù)的遺傳基礎(chǔ)極為狹窄[2]，限制了更高產(chǎn)優(yōu)良新品種的選育。多倍體育種與常規(guī)育種相比，除利用雜交產(chǎn)生的雜合效應(yīng)外，還能利用染色體加倍產(chǎn)生的基因劑量效應(yīng)[3-4]，是解決當(dāng)前橡膠樹(shù)育種困境的有效途徑之一。20世紀(jì)90年代，云南省熱帶作物科學(xué)研究所從GT1×PR107自然雜交后代中選育出高產(chǎn)抗寒新品種云研77-2和云研77-4，并在隨后被鑒定為三倍體[5-6]，表明橡膠樹(shù)多倍體育種是一條有效途徑。

獲得多倍體材料是開(kāi)展多倍體育種研究的基礎(chǔ)。胡東瓊等[7]于1982年報(bào)道從GT1子代中鑒定出了3株自然三倍體。劉陽(yáng)平[8]于1983年報(bào)道發(fā)現(xiàn)了1株自然三倍體。張?jiān)丛吹萚9-10]在橡膠樹(shù)GT1子代中鑒定出大量三倍體植株，為定向開(kāi)展橡膠樹(shù)三倍體選育種提供了材料基礎(chǔ)。除自然多倍體篩選外，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了大量人工誘導(dǎo)多倍體的研究，通過(guò)秋水仙堿處理生長(zhǎng)點(diǎn)和離體組織誘導(dǎo)四倍體、處理花器官誘導(dǎo)有性三倍體等方法，均獲得了多倍體植株[11]。

國(guó)家橡膠樹(shù)種質(zhì)資源圃保存著國(guó)內(nèi)規(guī)模最大、最完整的橡膠樹(shù)種質(zhì)資源材料，主要分為魏克漢（Wickham）種質(zhì)和1981IRRDB野生種質(zhì)兩部分。魏克漢種質(zhì)是指1876年由英國(guó)人魏克漢在亞馬遜河下游與塔帕若斯（Tapajos）河匯合處的博因（Boim）采集并培育的46 株母樹(shù)及其繁育的后代，是目前橡膠樹(shù)栽培品種的主要來(lái)源[12]。1981IRRDB野生種質(zhì)為國(guó)際橡膠研究和發(fā)展組織（International Rubber Research and Development Board， IRRDB）于1981年組織的多國(guó)聯(lián)合考察隊(duì)重返亞馬遜熱帶雨林采集的野生種質(zhì)資源[13]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)保存于國(guó)家橡膠樹(shù)種質(zhì)資源圃?xún)?nèi)的魏克漢種質(zhì)和野生種質(zhì)進(jìn)行全面的倍性鑒定，以期了解橡膠樹(shù)多倍體收集和保存情況，挖掘多倍體資源，為橡膠樹(shù)種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用和橡膠樹(shù)多倍體育種提供基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

試驗(yàn)材料取自國(guó)家橡膠樹(shù)種質(zhì)資源圃，資源圃位于海南省儋州市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)九隊(duì)。其中魏克漢種質(zhì)552份，1981IRRDB野生種質(zhì)5177份。每份種質(zhì)種植3株，芽接苗，株行距為1.5 m×1.5 m。

1.2? 方法

1.2.1? 倍性檢測(cè)? 植株倍性分析在Sysmex CyFlow?Cube8 流式細(xì)胞儀上進(jìn)行。分析方法參考儀器附送試劑使用方法（http：//www.sysmex-partec. com），即取200 mg新鮮葉片置于塑料培養(yǎng)皿中，添加0.5 mL裂解緩沖液，用刀片快速切碎，30 μm孔徑濾網(wǎng)過(guò)濾，添加1.6 mL DAPI染色體液，室溫靜置30 s后上機(jī)檢測(cè)。每份種質(zhì)隨機(jī)取其中1株的葉片進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)為多倍體的種質(zhì)則重檢所有植株確認(rèn)。已知二倍體作為對(duì)照。

1.2.2? 嵌合體不同倍性細(xì)胞比例分析? 嵌合體不同倍性細(xì)胞比例分析樣品處理方法同上，每個(gè)樣品檢測(cè)顆粒數(shù)不少于5000個(gè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)在FCS Express 6 plus中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用細(xì)胞周期分析模型計(jì)算不同倍性細(xì)胞的顆粒數(shù)。每份種質(zhì)重復(fù)檢測(cè)分析3次。

1.2.3? 氣孔性狀觀察? 觀察測(cè)量多倍體和嵌合體種質(zhì)的氣孔長(zhǎng)度、寬度和氣孔密度。對(duì)鑒定出的多倍體和嵌合體種質(zhì)的3株重復(fù)，每株取三出復(fù)葉的中間葉片3片，采用指甲油法[14]制作氣孔觀察裝片，在Leica DMBL顯微鏡40×物鏡下觀察，每片葉隨機(jī)選3個(gè)視野，用Leica DFC550顯微鏡相機(jī)拍照。每個(gè)視野中隨機(jī)取3個(gè)氣孔，使用ImageJ圖像分析軟件測(cè)量氣孔長(zhǎng)度和寬度，根據(jù)照片長(zhǎng)寬的像素?cái)?shù)和實(shí)際拍攝區(qū)域長(zhǎng)寬換算成實(shí)際長(zhǎng)度，每份種質(zhì)共測(cè)量27個(gè)氣孔的長(zhǎng)度和寬度。通過(guò)照片氣孔數(shù)量和照片所拍攝區(qū)域的面積計(jì)算氣孔密度，每份種質(zhì)獲得9個(gè)氣孔密度數(shù)據(jù)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和百分?jǐn)?shù)反正弦轉(zhuǎn)換，利用IBM SPSS Statistics 22中文版軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 流式細(xì)胞倍性檢測(cè)

流式細(xì)胞倍性檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，二倍體的DNA相對(duì)含量為100（圖1A），三倍體植株為150（圖1B），四倍體植株為200（圖1C），嵌合體則在100和200位置均有波峰（圖1D）。

種質(zhì)倍性鑒定統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1，從552份魏克漢種質(zhì)中檢測(cè)出三倍體9份，占比為1.63%，四倍體2份，占比為0.36%，嵌合體14份，占比為2.54%。從5177份1981IRRDB野生種質(zhì)中鑒定出三倍體11份，占比為0.21%，四倍體1份，占比為0.02%。多倍體種質(zhì)名單見(jiàn)表2。

2.2? 嵌合體細(xì)胞倍性分析

魏克漢種質(zhì)中的14份嵌合體均為人工誘導(dǎo)

的多倍體，當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是穩(wěn)定的四倍體，但在本研究中被鑒定為嵌合體。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)嵌合體四倍體細(xì)胞的比例進(jìn)行分析（圖2和圖3），結(jié)果表明，14份嵌合體的四倍體細(xì)胞比例在49.06%～78.26%之間，種質(zhì)間差異極顯著。多重比較表明四倍體細(xì)胞比例最高的是紅星1多，比例最低的是PR107多。

2.3? 多倍體氣孔性狀分析

橡膠樹(shù)嵌合體、三倍體和四倍體的氣孔性狀

分析結(jié)果表明（圖3和圖4），不同倍性間的氣孔長(zhǎng)度、寬度和密度差異均極顯著（P<0.01）。嵌合體、三倍體和四倍體的氣孔長(zhǎng)度分別為13.31～ 22.12、14.06～27.41、16.48～27.90 μm，氣孔寬度分別為7.53～14.44、9.14～16.72、7.85～7.23 μm，氣孔密度分別為442.67～822.11、274.04～855.35、231.88～358.35 mm2。氣孔長(zhǎng)度和寬度的排序?yàn)樗谋扼w>三倍體>嵌合體，氣孔密度的排序相反。氣孔長(zhǎng)度和寬度間相關(guān)性系數(shù)為0.56，氣孔長(zhǎng)度和氣孔密度間相關(guān)系數(shù)為0.72，氣孔寬度和氣孔密度間相關(guān)系數(shù)為0.52，相關(guān)性均極顯著（P< 0.01）。嵌合體中四倍體細(xì)胞的比例與氣孔長(zhǎng)度、寬度和密度之間相關(guān)性均不顯著。

3? 討論

流式細(xì)胞術(shù)是大規(guī)模檢測(cè)植物倍性的有效手段，具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已在多種植物的種質(zhì)資源倍性鑒定中得到應(yīng)用[15-18]。本研究利用流式細(xì)胞儀對(duì)5729份橡膠樹(shù)魏克漢和1981IRRDB野生種質(zhì)資源的倍性進(jìn)行檢測(cè)，在魏克漢種質(zhì)中鑒定出多個(gè)三倍體、四倍體和嵌合體，并首次在野生種質(zhì)資源中發(fā)現(xiàn)了三倍體和四倍體，表明在亞馬遜熱帶雨林中存在天然橡膠樹(shù)多倍體。植物三倍體的產(chǎn)生有兩種途徑：（1）二倍體產(chǎn)生的未減數(shù)配子（2n）和減數(shù)配子（n）融合;（2）

四倍體產(chǎn)生的減數(shù)配子（2n）和二倍體產(chǎn)生的n配子融合。植物四倍體的產(chǎn)生同樣有2種途徑：（1）二倍體產(chǎn)生的未減數(shù)雌配子（2n）和未減數(shù)雄配子（2n）融合;（2）二倍體經(jīng)體細(xì)胞加倍后發(fā)育成植株。未減數(shù)配子是植物多倍體產(chǎn)生的主要途徑[9-10]，而在橡膠樹(shù)魏克漢種質(zhì)中已發(fā)現(xiàn)自然產(chǎn)生未減數(shù)配子的無(wú)性系，并獲得了三倍體[19-20]和四倍體（待發(fā)表）子代，推測(cè)橡膠樹(shù)野生三倍體和四倍體有為2n配子融合產(chǎn)生的可能性較高，具體有待進(jìn)一步研究。

前人在20世紀(jì)8090年代，通過(guò)秋水仙堿處理橡膠樹(shù)的生長(zhǎng)點(diǎn)和離體組織等方法獲得了大量多倍體[7-8， 21-26]，這些多倍體植株中四倍體細(xì)胞比例在60%～100%之間。雖稱(chēng)之為多倍體，但多數(shù)實(shí)為嵌合體，部分嵌合體長(zhǎng)期保存在橡膠樹(shù)種質(zhì)資源圃?xún)?nèi)。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，嵌合體植株可經(jīng)過(guò)截干復(fù)幼而長(zhǎng)期保存，但四倍體細(xì)胞的比例略有下降。這些嵌合體的外部形態(tài)同四倍體相似，均有葉片寬大、葉色深綠、葉片加厚等特點(diǎn)，通過(guò)外部形態(tài)難以區(qū)分。此外，在野生種質(zhì)四倍體的3株重復(fù)中發(fā)現(xiàn)其中1株為嵌合體，推測(cè)為四倍體接穗和二倍體砧木共同發(fā)育形成，具體有待進(jìn)一步研究。

氣孔長(zhǎng)度和寬度增大、密度降低是植物多倍體的特征之一[27-28]。橡膠樹(shù)多倍體的氣孔性狀差異亦有研究，周鐘毓等[29]比較了人工活體誘導(dǎo)獲得的橡膠樹(shù)多倍體的氣孔性狀，發(fā)現(xiàn)多倍體的氣孔長(zhǎng)度、寬度比二倍體植株大10%，氣孔密度小10%。張?jiān)丛吹萚30]比較了橡膠樹(shù)二、三、四倍體的氣孔性狀差異，發(fā)現(xiàn)隨著倍性的提高，氣孔的長(zhǎng)度和寬度均增大，氣孔密度變小。本研究結(jié)果與之前研究相似，并發(fā)現(xiàn)嵌合體的氣孔長(zhǎng)度和寬度小于三倍體，密度大于三倍體。

本研究對(duì)橡膠樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行全面的倍性鑒定，發(fā)掘出多份橡膠樹(shù)多倍體種質(zhì)資源，補(bǔ)充和完善了橡膠樹(shù)種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)，為開(kāi)展橡膠樹(shù)多倍體育種研究提供了材料基礎(chǔ)。

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