★ 羅宇琴 楊文惠 潘禮業(yè) 魏梅 陳向東 馬瑞瑞 吳文平 霍文杰 李國衛(wèi)* 孫冬梅（廣東一方制藥有限公司 廣東 佛山 528244）

紫蘇子為唇形科植物紫蘇Perillafrutescens（L.）Britt. 的干燥成熟果實(shí)，秋季果實(shí)成熟時(shí)采收，除去雜質(zhì)，曬干，紫蘇資源在我國分布范圍較廣，分布于廣東、廣西、湖北、云南、貴州、四川、臺(tái)灣、浙江、安徽、福建等省區(qū)［1］，紫蘇屬植物喜溫、短日照，適應(yīng)能力強(qiáng)，目前在我國的東北、西北、東南及西南地區(qū)21個(gè)省均有種植。其性溫，味辛，具有降氣化痰，止咳平喘，潤腸通便的功能，臨床主要用于治療痰壅氣逆，咳嗽氣喘，腸燥便秘等［2］。

目前對(duì)紫蘇子的炒制工藝多為清炒，如《中國藥典》2015年版［2］紫蘇子飲片項(xiàng)下為“取凈紫蘇子，照清炒法，炒至有爆聲”，《天津市中藥飲片炮制規(guī)范》［3］為“將鍋加熱，取凈蘇子置鍋內(nèi)，炒至表面顔色加深，嗅有香氣逸出時(shí)，取出，放涼”?！逗鲜≈兴庯嬈谥埔?guī)范》［4］為“取凈蘇子，用文火炒至有爆聲，取出，放涼”?！渡虾Ｊ兄兴庯嬈谥埔?guī)范》［5］為“取生紫蘇子，照清炒法，炒至有爆聲”，但上述炒制方法均為經(jīng)驗(yàn)性的術(shù)語難以進(jìn)行量化控制，均未對(duì)炒制過程進(jìn)行規(guī)范化說明。同時(shí)，紫蘇子生品善于潤燥滑腸，而炒后善于溫肺降氣的藥效作用增強(qiáng)，未能說明紫蘇子炒制過程中到底是哪些化學(xué)成分發(fā)生了變化，是否產(chǎn)生了新的化學(xué)成分，這些產(chǎn)生的化學(xué)變化與炒制后辛散之性緩和及溫肺降氣作用增強(qiáng)之間有何聯(lián)系［6］。因此需要進(jìn)一步針對(duì)種子類中藥炒制過程成分變化規(guī)律進(jìn)行分析和研究［7］。本研究擬通過正交試驗(yàn)，優(yōu)選紫蘇子飲片炒制工藝參數(shù)，同時(shí)說明不同炒制工藝對(duì)紫蘇子化學(xué)成分的影響，為炒制過程的規(guī)范化及炒紫蘇子的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Waters高效液相色譜儀（Waters e2695），Waters超高效液相色譜儀（H-Class），Agilent SB C18色 譜 柱（4.6mm×150mm，5μm），Agilent SB C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.8μm）；萬分之一天平（梅特勒-托利多公司，ME204E）；百萬分之一天平（梅特勒-托利多公司，XP26）；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司，HWS-28）；數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；電陶爐（江蘇九陽，H22-X3）；超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司，Milli-Q Direct）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 咖啡酸（批號(hào)：110885-201703，純度：99.7%）、迷迭香酸（批號(hào)：110871-201706，純度：90.5%）、木犀草素（批號(hào)：111520-201605，純度：99.6%）對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院；水為超純水，其他試劑為分析純。本實(shí)驗(yàn)所用的紫蘇子藥材由廣東一方制藥有限公司提供，采自甘肅省慶陽寧縣春榮鎮(zhèn)，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為Perillafrutescens（L.）Britt.的干燥成熟果實(shí)，樣品保存于質(zhì)量中心。

2 方法

2.1 紫蘇子的炒制方法優(yōu)化 本試驗(yàn)在傳統(tǒng)炒制工藝基礎(chǔ)上，取凈選后的紫蘇子100g，平行9份，采用正交設(shè)計(jì)來對(duì)電炒鍋功率（A）、炒制時(shí)間（B）、翻動(dòng)頻率（C）進(jìn)行優(yōu)選，每個(gè)因素取3個(gè)水平，見表1。分別以迷迭香酸含量及基于主成分分析的4個(gè)特征峰峰面積/稱樣量標(biāo)準(zhǔn)化值為指標(biāo)，進(jìn)行炒制工藝評(píng)價(jià)。

表1 紫蘇子炒制工藝參數(shù)設(shè)計(jì)

2.2 迷迭香酸含量測定方法 參照中國藥典2015年版紫蘇子項(xiàng)下含量測定方法。

2.3 紫蘇子特征圖譜方法

2.3.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（柱長100mm，內(nèi)徑2.1mm，粒徑1.8μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，按梯度洗脫（0～6min，10% → 18%A；6～15min，18% → 50%A）；流速為0.3mL/min；檢測波長為330nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為2μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素對(duì)照品適量，加甲醇配制成每mL各含咖啡酸3μg、迷迭香酸 40μg、木犀草素 5μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取紫蘇子飲片（過二號(hào)篩）適量，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 取紫蘇子飲片（過二號(hào)篩）適量，取約0.5g，精密稱定，按照“2.3.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別取空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液，各進(jìn)樣2μL，結(jié)果見圖1。

圖1 紫蘇子特征圖譜專屬性考察

通過專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該分析方法能正確檢測所指認(rèn)的特征峰，不受提取溶劑的干擾。

2.4.2 精密度考察 取紫蘇子藥材按照“2.3.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積2μL。以迷迭香酸峰為參照峰，計(jì)算其他特征峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD值，結(jié)果各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD＜1%，該儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取紫蘇子藥材按照“2.3.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0，1，2，4，8，12小時(shí)進(jìn)樣，進(jìn)樣體積2μL。以迷迭香酸峰為參照峰，計(jì)算其他特征峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD值，結(jié)果12小時(shí)內(nèi)各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1%，相對(duì)峰面積的RSD＜5%，說明該供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性考察 取同一批紫蘇子約0.5g，精密稱定，平行6份，按按照“2.3.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件，分別進(jìn)樣2μL。以迷迭香酸峰為參照峰，計(jì)算其他特征峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD值，結(jié)果各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間＜1%，相對(duì)峰面積的RSD＜5%，說明該方法重復(fù)性較好。

2.5 樣品測定 基于已建立的特征圖譜方法對(duì)紫蘇子不同炒制品進(jìn)行測定，以迷迭香酸峰為參照峰，分別計(jì)算各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

3 結(jié)果與分析

3.1 迷迭香酸含量測定結(jié)果 參照中國藥典2015年版紫蘇子項(xiàng)下含量測定方法，對(duì)不同炒制工藝紫蘇子水分及迷迭香酸含量測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在該炒制工藝下，紫蘇子炒制品均符合中國藥典2015版炒紫蘇子項(xiàng)下含量限度（以迷迭香酸計(jì)，不得低于0.20%）。但以迷迭香酸作為單指標(biāo)評(píng)價(jià)紫蘇子炒制工藝缺乏一定合理性。

表2 不同炒制工藝迷迭香酸含量測定結(jié)果 %

3.2 特征圖譜測定結(jié)果 特征圖譜測定結(jié)果表明，以迷迭香酸為S峰，分別計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值，結(jié)果見表3～4，同一批次紫蘇子飲片不同試驗(yàn)號(hào)樣品特征圖譜的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.02%～0.74%，偏差較小，相對(duì)峰面積RSD值在4.68%～128.07%，波動(dòng)較大，說明不同炒制工藝間樣品特征圖譜差異較大。9批樣品疊加圖見圖2。

表3 紫蘇子不同炒制品特征圖譜結(jié)果（相對(duì)保留時(shí)間）

表4 紫蘇子不同炒制品特征圖譜結(jié)果（相對(duì)峰面積）

圖2 炒紫蘇子特征圖譜疊加圖

3.3 紫蘇子炒制工藝參數(shù)優(yōu)化

3.3.1 主成分分析 不同炒制工藝中經(jīng)特征圖譜結(jié)果發(fā)現(xiàn)明顯產(chǎn)生特征峰X1、X2，說明經(jīng)炒制后有明顯成分變化，為進(jìn)一步說明炒制參數(shù)的合理性以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，因此需進(jìn)一步對(duì)炒制工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。本研究以特征峰峰面積/稱樣量為指標(biāo)對(duì)不同炒制品進(jìn)行研究，結(jié)果見表5。

應(yīng)用SPSS20.0軟件對(duì)紫蘇子不同炒制品的特征峰峰面積進(jìn)行主成分分析，選擇特征值＞1的指標(biāo)為主成分，結(jié)果提取出兩個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到94.56%。結(jié)果見表6。因此選擇提取的兩個(gè)主成分進(jìn)行分析，從旋轉(zhuǎn)成分矩陣來看，第一主成分主要反映了來自原始色譜峰1、2（咖啡酸）、3、4、5、6（迷迭香酸）的信息，第二主成分主要反映了來自原始色譜峰X1、X2、7的信息，因此根據(jù)各特征峰對(duì)主成分的影響系數(shù)，其中峰5、峰6（迷迭香酸）對(duì)主成分1影響較大，峰7（木犀草素）、X1、X2對(duì)主成分2影響較大，結(jié)果見表7。

表5 炒紫蘇子特征圖譜峰面積/稱樣量值

表6 解釋的總方差

表7 旋轉(zhuǎn)成份矩陣a

3.3.2 方差分析 基于主成分分析結(jié)果，選已知峰迷迭香酸及木犀草素為指標(biāo)考察紫蘇子的炒制工藝，以迷迭香酸及木犀草素特征峰峰面積/稱樣量，按公式Xij’=Xij/Xijmax進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，Xij’為樣品中第i類成分j的標(biāo)準(zhǔn)化值，Xij為樣品中第i類成分j的值，Xijmax為樣品中第i類成分j的最大值。經(jīng)文獻(xiàn)研究，紫蘇子經(jīng)炒制后，黃酮類成分含量較生品增加，而迷迭香酸因受熱易分解，因此按照炒制工藝選擇中的主次地位，賦予不同的加權(quán)系數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)化后的值Xij’加權(quán)后求和，及綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)Y=迷迭香酸×12%+木犀草素×88%），結(jié)果見表8。進(jìn)一步將Y值代入正交試驗(yàn)表，正交試驗(yàn)結(jié)果見表9，得到方差分析結(jié)果見表10。

直觀分析結(jié)果表明，三因素對(duì)結(jié)果影響的大小順序?yàn)椋弘姵村伖β剩痉瓌?dòng)頻率＞炒制時(shí)間。方差分析結(jié)果表明，影響因素A的水平變化對(duì)于炒制工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，考慮到因素B（炒制時(shí)間）在水平1和水平3差異不大，因此綜合得到最佳炒制工藝為A3B1C2，即控制鍋溫為190℃，電炒鍋功率為1000W，炒制時(shí)間4min，翻炒頻率為60次/min。

表8 炒紫蘇子標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)處理結(jié)果

表9 炒紫蘇子正交試驗(yàn)結(jié)果表

表10 炒紫蘇子方差分析表

3.4 紫蘇子炒制工藝驗(yàn)證 另平行稱取三批紫蘇子，按照上述炒制工藝，進(jìn)行炒制，得到三批樣品工藝驗(yàn)證，含量測定結(jié)果見表11，特征圖譜相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積結(jié)果見表12～13。結(jié)果表明，三批樣品工藝驗(yàn)證迷迭香酸含量測定均值為0.33%，RSD值為1.11%，說明，三批樣品含量無明顯差異，三批樣品相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.00%～1.30%，說明各特征峰相對(duì)保留時(shí)間偏差較小，但相對(duì)峰面積RSD值波動(dòng)較大，可能與峰面積較小有關(guān)。整體來看，三批樣品炒制工藝的重現(xiàn)性較好。

表11 炒紫蘇子工藝驗(yàn)證含量測定結(jié)果 %

表12 炒紫蘇子工藝驗(yàn)證特征圖譜結(jié)果（相對(duì)保留時(shí)間）

表13 炒紫蘇子工藝驗(yàn)證特征圖譜結(jié)果（相對(duì)峰面積）

4 討論

（1）考察影響紫蘇子特征圖譜的前處理方式，分別以甲醇、乙醇、80%甲醇、50%甲醇、稀乙醇作為提取溶劑時(shí)，其中50%甲醇及稀乙醇對(duì)木犀草素提取效率不高，整體以80%甲醇提取效率較高；分別考察超聲提取及加熱回流，發(fā)現(xiàn)兩者的提取效率相當(dāng)，為操作的簡便性，選超聲提取方式；分別對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行分析，超聲15、30、45min時(shí)，對(duì)色譜峰的提取效率相當(dāng)，為保證提取充分，選擇超聲時(shí)間為30min。

（2）紫蘇子經(jīng)炒制后迷迭香酸含量明顯降低，結(jié)合特征圖譜數(shù)據(jù)來看，從試驗(yàn)號(hào)1～試驗(yàn)號(hào)9，峰1、峰2（咖啡酸）、峰3的相對(duì)峰面積均呈現(xiàn)明顯下降趨勢，峰4、峰5的相對(duì)峰面積變化較為平緩，而峰X1、X2的相對(duì)峰面積呈現(xiàn)明顯梯度性上升趨勢，推測，兩者的峰面積變化與溫度有關(guān)，存在一個(gè)溫度拐點(diǎn)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)通過紅外測溫槍對(duì)炒制過程中的溫度進(jìn)行測定，從試驗(yàn)號(hào)1～9物料的出鍋溫度來看，其中試驗(yàn)號(hào)1的出鍋溫度為110℃，試驗(yàn)號(hào)2～3的出鍋溫度為125℃～130℃，試驗(yàn)號(hào)4～5的出鍋溫度為140℃～145℃，試驗(yàn)號(hào)6的出鍋溫度為157.2℃，試驗(yàn)號(hào)7的出鍋溫度為170℃，試驗(yàn)號(hào)6的出鍋溫度為185℃，試驗(yàn)號(hào)6的出鍋溫度為200℃，因此推測，該溫度拐點(diǎn)可能在165℃～170℃。同時(shí)結(jié)合特征峰X1的紫外最大吸收分別在248nm與340nm，特征峰X2的最大吸收分別在243nm與344nm，位于黃酮類成分的紫外吸收區(qū)，推測可能為黃酮類成分，這可能是由于在炒制過程中該物質(zhì)化學(xué)鍵發(fā)生改變，導(dǎo)致原來沒有紫外吸收度物質(zhì)具有較強(qiáng)的紫外吸收。

（3）基于主成分分析，結(jié)合特征圖譜方法對(duì)紫蘇子炒制工藝進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)，當(dāng)物料溫度為165℃～170℃時(shí)，咖啡酸、迷迭香酸等酚酸類成分明顯降低，而木犀草素等黃酮類成分增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。根據(jù)“逢子必炒”的基本原則，經(jīng)炒制后，紫蘇子揮發(fā)油含量降低，咖啡酸、迷迭香酸等酚酸類成分明顯降低，而木犀草素等黃酮類成分增加，與炒紫蘇子燥性減弱而溫肺降氣作用增強(qiáng)結(jié)論一致。但具體成分變化機(jī)制有待進(jìn)一步研究。