★ 章國(guó)良 項(xiàng)穎卿 饒麗華 徐向群（.江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 南昌 330003；.江西科技學(xué)院 南昌 330098）

自噬是細(xì)胞受到刺激后溶酶體對(duì)自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的吞噬降解，包括自噬誘導(dǎo)、形成自噬體膜、形成自噬體、自噬體與溶酶體的融合以及降解內(nèi)容物等過(guò)程［1］。眾多研究表明，在缺血性損傷之前激活內(nèi)源性自噬水平可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用［2］。在缺血性損傷發(fā)生后過(guò)度自噬反而惡化神經(jīng)元損傷（自噬性細(xì)胞死亡）［3］。自噬的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，多條信號(hào)通路參與了自噬的調(diào)節(jié)，如PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路、AMPK-mTORC1 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、核因子 NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路等［4］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，珍龍醒腦能促進(jìn)血管性癡呆大鼠腦組織P13K和Akt蛋白表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［5］。本研究主要觀察珍龍醒腦是否能激活PI3K/Akt通路下游基因mTOR活性，抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬性死亡，觀察該藥對(duì)自噬相關(guān)基因Beclin-1表達(dá)和自噬活性微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）II與I比值的影響，為珍龍醒腦臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠，鼠齡3～4個(gè)月，體重（250±30）g，購(gòu)買(mǎi)自江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物科技中心，生產(chǎn)合格證號(hào)SCXK（贛）2018-0003。實(shí)驗(yàn)前普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度24～26℃，普通光照。

1.2 藥物與試劑 珍龍醒腦膠囊（青海金訶藏藥藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026000），包含紫檀香、西紅花、珍珠、訶子、塞北紫堇、冬葵果、短穗兔耳草、余甘子、訶子、麝香、木香、人工牛黃等29味中藥，規(guī)格0.3g/粒，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備成10mg/mL的混懸液。自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1兔抗鼠多克隆抗體，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。SP 法免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒，均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 分組與給藥 72只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、珍龍醒腦組，每組又分為造模術(shù)后1周、2周、4周和8周4個(gè)亞組，每組6只。造模成功后給予珍龍醒腦混懸液200 mg/kg灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水，1次/d，各亞組分別給藥1周、2周、4周和8周。

1.4 造模及取材 采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉法制作VD模型［6］。在相應(yīng)時(shí)間段取大鼠稱重，采用10%水合氯醛腹腔注射（350mg/kg）進(jìn)行麻醉，暴露頸部手術(shù)視野，碘伏消毒，取正中矢狀切口，依次切開(kāi)皮膚、皮下組織和筋膜，無(wú)齒鑷在雙側(cè)頸動(dòng)脈三角處鈍性分離迷走神經(jīng)，游離出頸總動(dòng)脈，取4號(hào)絲線結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，阻斷血流，縫合切口。假手術(shù)組除不結(jié)扎阻斷頸總動(dòng)脈外，其余手術(shù)步驟相同。手術(shù)過(guò)程中大鼠肛溫控制在36℃～37℃，防止低溫對(duì)腦缺血損傷產(chǎn)生的保護(hù)作用，術(shù)后注射青霉素20萬(wàn)U預(yù)防感染。造模3天后，按Longa5分評(píng)分法對(duì)各組大鼠進(jìn)行腦缺血損傷評(píng)分，2分及以上者為造模成功。模型制作成功后，在各時(shí)間點(diǎn)取材，水合氯醛過(guò)量麻醉，大鼠仰臥于操作臺(tái)上，迅速開(kāi)胸暴露心臟，取輸液導(dǎo)管自升主動(dòng)脈插管后固定針頭，剪開(kāi)右心耳，快速灌注0.9%NS溶液250mL，待大鼠肝臟血管床變蒼白，流出灌注液清澈后，用4%多聚甲醛250mL灌注，直到大鼠身體抽動(dòng)，頭部變硬，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和腦干。冰盤(pán)上迅速分離大腦半球，取視交叉前后約3mm范圍的冠狀切片，放人10%福爾馬林中固定，24h之內(nèi)石蠟包埋、切片。

1.5 海馬CA1區(qū)mTOR、Beclin-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 取石蠟切片，脫蠟至水。采用SP免疫組化法觀察mTOR、Beclin-1蛋白表達(dá)。陰性對(duì)照組以0.01MPBS代替一抗，其余步驟不變。高倍鏡下隨機(jī)選取海馬CAl區(qū)不重疊6個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.6 海馬CA1區(qū)LC3II/I比值檢測(cè) 采用Westernblot法檢測(cè)大鼠海馬LC3蛋白表達(dá)。各組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別取6只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射（350mg/kg）進(jìn)行麻醉，斷頭取腦。冰盤(pán)上迅速分離大腦半球，用4℃PBS清洗，分離出海馬。向其中加入裂解液，充分裂解，移至1.5mL離心管中，然后在4℃下12000rpm離心10min，提取海馬總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳法進(jìn)行蛋白質(zhì)分離后經(jīng)轉(zhuǎn)膜，封閉，加入LC3抗體放置4℃冰箱孵育12h。TBST 清洗一抗，加二抗室溫孵育1h，TBST 洗脫二抗，滴注ECL 發(fā)光液顯色。用Quantity-One 圖像分析軟件測(cè)定目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶的光密度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)mTOR蛋白表達(dá)的影響 在光學(xué)顯微鏡下，mTOR陽(yáng)性細(xì)胞被染色成棕黃色，主要在神經(jīng)元的核膜、胞漿及軸突表達(dá)。假手術(shù)組未見(jiàn)或僅見(jiàn)少量mTOR陽(yáng)性細(xì)胞。模型組可見(jiàn)海馬CA1區(qū)內(nèi)有大量mTOR陽(yáng)性細(xì)胞存在。結(jié)果顯示，雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷血流后1周，mTOR陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，此后mTOR逐漸升高，至第4周達(dá)到高峰，第8周呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。模型組和珍龍醒腦組各時(shí)間段mTOR陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量均高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。珍龍醒腦組各時(shí)間段mTOR陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量與模型組比較明顯增加，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 珍龍醒腦對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)mTOR蛋白表達(dá)的影響（±s，n=24） 分

表1 珍龍醒腦對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)mTOR蛋白表達(dá)的影響（±s，n=24） 分

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別大鼠VD造模術(shù)后1周 2周 4周 8周假手術(shù)組 9.53±1.42 9.97±1.68 9.25±1.53 9.46±0.96模型組 18.58±1.69* 25.07±1.62* 32.74±1.75* 29.77±1.47*珍龍醒腦組 26.03±2.07*△ 30.12±1.94*△ 47.69±2.58*△ 39.13±1.95*△

2.2 對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)Beclin-1蛋白表達(dá) 在光學(xué)顯微鏡下，Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞被染色成棕黃色，主要表達(dá)在神經(jīng)元的核膜、胞漿，少量在軸突表達(dá)。假手術(shù)組未見(jiàn)或僅見(jiàn)少量Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞。模型組可見(jiàn)海馬CA1區(qū)內(nèi)有大量Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞存在。結(jié)果顯示，雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷血流后1周，Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，此后Beclin-1逐漸升高，至第4周達(dá)到高峰，第8周呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。模型組各時(shí)間段Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。珍龍醒腦組各時(shí)間段Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量與模型組比較明顯減少（P均＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 珍龍醒腦對(duì)大鼠海馬CA1區(qū) Beclin-1蛋白表達(dá)的影響（±s，n=24） 個(gè)

表2 珍龍醒腦對(duì)大鼠海馬CA1區(qū) Beclin-1蛋白表達(dá)的影響（±s，n=24） 個(gè)

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.01.

組別大鼠VD造模術(shù)后1周 2周 4周 8周假手術(shù)組 10.10±1.38 10.55±1.57 10.44±1.59 10.46±1.13模型組 22.16±1.75* 32.15±1.47* 53.33±2.36* 37.27±1.99*珍龍醒腦組 20.56±1.33*△ 28.07±1.69*△ 36.34±1.86*△ 22.57±1.64*△

2.3 對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)LC3-II/LC3-I比值的影響 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組與珍龍醒腦組各時(shí)間段LC3-II/LC3-II比值明顯增高，以第4周比值升高最顯著，8周后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。各時(shí)間段亞組與模型組比較，大鼠海馬CA1區(qū)LC3-II/LC3-I比值均明顯降低（P＜0.05或P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 珍龍醒腦對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)LC3-II/LC3-I比值的影響（±s，n=24）

表3 珍龍醒腦對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)LC3-II/LC3-I比值的影響（±s，n=24）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，△P＜0.01.

組別大鼠VD造模術(shù)后1周 2周 4周 8周假手術(shù)組 0.30±0.05 0.31±0.02 0.31±0.03 0.31±0.06模型組 0.46±0.07* 0.49±0.04* 0.55±0.08* 0.43±0.04*珍龍醒腦組 0.40±0.04*# 0.42±0.02*△ 0.44±0.05*△ 0.38±0.02*#

3 討論

自噬廣泛存在于真核生物中，是一高度保守的細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)壽蛋白和細(xì)胞器的降解途徑，參與清除細(xì)胞廢物、結(jié)構(gòu)重建和生長(zhǎng)分化等［7-8］。自噬一方面是細(xì)胞對(duì)細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激如饑餓或氧化應(yīng)激等的一種保護(hù)性反應(yīng)，適度激活可以幫助細(xì)胞降解壞死的細(xì)胞器，清除異常蛋白、防止蛋白聚集，從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，另一方面，過(guò)度的自噬在大量降解壞死細(xì)胞器的同時(shí)，過(guò)度消耗細(xì)胞的能量，可誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡，即II 型程序性細(xì)胞死亡［9］。研究證實(shí)，在VD損傷中，海馬自噬相關(guān)蛋白表達(dá)以及自噬活性有顯著增高［10-11］。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞自噬過(guò)程中發(fā)揮著極其重要作用，mTOR作為該通路中調(diào)控自噬的重要位點(diǎn)，它的活性是自噬體形成、成熟的關(guān)鍵［12］。mTOR可抑制自噬起始分子ULKl的活性，降低缺血性腦損傷神經(jīng)元自噬的發(fā)生水平［1］。Beclin1是酵母Apg6/Vps30基因的同源物，是介導(dǎo)哺乳動(dòng)物自噬過(guò)程的首個(gè)被確認(rèn)的基因。Beclin-1可以與 PI3K結(jié)合形成復(fù)合物，其可以招募胞漿中的Atg5復(fù)合物和LC3，進(jìn)而促進(jìn)自噬體擴(kuò)張伸展，形成完整自噬體，參與自噬體膜的早期形成［13］。Beclin1是細(xì)胞自噬過(guò)程中重要的正性調(diào)節(jié)因子，常作為衡量自噬水平的重要參考指標(biāo)［10］。LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母Atg8基因的同源物，主要作用于自噬體后期形成過(guò)程中，即前自噬體的延長(zhǎng)和閉環(huán)［14］。LC3可分為 LC3-I和 LC3 II 兩種形式。LC3 前體（pro-LC3）先被Atg4切割，形為胞漿型的LC3I。LC3I經(jīng)過(guò)剪切和泛素化加工修飾，與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺相結(jié)合，形成LC3-II。LC3-II定位于膜結(jié)構(gòu)的前自噬體或自噬體，是自噬體的標(biāo)記性蛋白［15］。LC3 II總量或者膜結(jié)合型LC3II與胞漿可溶性LC3 I的比值可定量評(píng)估自噬水平，是反映自噬活性高低的一個(gè)有效指標(biāo)［16］。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠VD造模術(shù)后1周，Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，LC3II/LC3 I比值升高，至第4周達(dá)到高峰，第8周回落，表明神經(jīng)元發(fā)生了自噬；這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)學(xué)者［10-11］相關(guān)報(bào)道一致。經(jīng)過(guò)珍龍醒腦灌胃治療后，與模型組比較，VD大鼠海馬CA1區(qū)LC3II/LC3 I比值降低，Beclin 1蛋白表達(dá)減少。提示珍龍醒腦可以抑制自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3的產(chǎn)生，減少LC3II/LC3 I比值，抑制神經(jīng)元過(guò)度自噬現(xiàn)象。課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，珍龍醒腦膠囊制成混懸制劑灌胃，能促進(jìn)VD大鼠海馬CA1區(qū)PI3K和Akt蛋白表達(dá)，改善VD大鼠的空間探索能力和學(xué)習(xí)記憶能力［5］。本研究采用免疫組化檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路下游因子mTOR蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示VD組大鼠mTOR蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均增高。與模型組比較，使用珍龍醒腦灌胃后，VD大鼠的mTOR蛋白表達(dá)呈現(xiàn)進(jìn)一步升高趨勢(shì)，至第4周達(dá)到高峰值，提示，mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞過(guò)度自噬過(guò)程中發(fā)揮抑制作用，珍龍醒腦能促進(jìn)PI3K和Akt蛋白表達(dá)，激活mTOR活性，降低LC3II/LC3 I比值，抑制VD大鼠海馬神經(jīng)元過(guò)度自噬，從而減輕神經(jīng)元損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究未涉及到PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑，有待在今后的實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)一步完善。