張士林，李敏，陳輝，孫文，項(xiàng)靈云,，馮覺平★

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢；2.武漢市第四醫(yī)院（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院）腫瘤科，湖北 武漢；3.江漢大學(xué)，湖北 武漢）

0 引言

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是胃腸道中最常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)、放化療及分子靶向是其主要治療手段[1]。近年來研究表明，中醫(yī)藥對CRC 有較好的輔助治療效果[2]。

結(jié)直腸腫瘤歸屬于中醫(yī)的“腸覃”“腸風(fēng)”“積聚”“腸積”“鎖肛痔”等，現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為CRC 的病因?yàn)榘┒景l(fā)于內(nèi)，瘀結(jié)于腸腑，與多種病邪互結(jié)，導(dǎo)致機(jī)體正氣失衡，無法抵御癌毒[3-4]。故通過辨證診治，采用化瘀散結(jié)、補(bǔ)益氣血等方法治療[5-6]。白術(shù)當(dāng)歸湯由歸脾湯化裁而來，藥物組成為白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、黃芪、木香、甘草、白藥蛇舌草。取其補(bǔ)益氣血，健脾養(yǎng)心之功效。但有關(guān)白術(shù)當(dāng)歸湯治療CRC 機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究尚未見報導(dǎo)，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法、白術(shù)當(dāng)歸湯的化學(xué)成分、化學(xué)分子靶標(biāo)、CRC 相關(guān)基因-蛋白相互作用等信息，構(gòu)建“中藥化合物活性成分靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”“中藥化合物活性成分靶點(diǎn)-腸癌靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”，系統(tǒng)探討白術(shù)當(dāng)歸湯治療腸癌的多成分、多靶點(diǎn)、多通路復(fù)雜機(jī)制，為后續(xù)研究提供信息。

1 資料和方法

1.1 白術(shù)當(dāng)歸七物湯的活性成分及靶點(diǎn)篩選

本研究依托于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以白術(shù)當(dāng)歸七物湯的組成成分：白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、黃芪、木香、甘草、蛇草；檢索本方所有化學(xué)成分，以生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥40%和類藥性（Druglikeness，DL）≥0. 2 作為活性化合物的篩選條件，提取相應(yīng)的活性成分。應(yīng)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫平臺檢索白術(shù)當(dāng)歸湯所有活性成分的靶基因。

1.2 大腸癌的疾病靶點(diǎn)篩選

GeneCard 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.genecards.org/）及OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）中，以“Colorectal cancer”為檢索詞，篩選得到CRC 的靶點(diǎn)，并應(yīng)用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對所篩選的靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 活性成分與CRC 共同靶點(diǎn)篩選

應(yīng)用R 語言（https）軟件3.6.2，通過編程將CRC 靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行交集，并繪制韋恩圖。

1.4 Protein-protein interaction（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

CRC 與藥物共同靶點(diǎn)輸入在STRING（http：//string-db.org/cgi/input.pl）數(shù)據(jù)中，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，構(gòu)建共同靶點(diǎn)互作用網(wǎng)絡(luò)PPI，評分條件設(shè)定為大于0.4，保證信息的置信度，隱藏孤立蛋白質(zhì)，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用count.R 插件獲得共同蛋白靶點(diǎn)出現(xiàn)的頻次。

1.5 白術(shù)當(dāng)歸七物湯藥物活性成分-CRC-靶點(diǎn)互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.2 軟件中Merge 功能構(gòu)建白術(shù)當(dāng)歸七物湯藥物活性成分-CRC-靶點(diǎn)互作用網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中“Node”代表活性成分和靶點(diǎn)，“Edge”代表活性成分-CRC-靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系。

1.6 差異基因GO（Gene Ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因組百科全書）通路富集分析

利用R 語言（http）軟件對白術(shù)當(dāng)歸七物湯藥物活性成分與CRC 的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，GO 分析主要用于描述基因產(chǎn)物的功能，包括細(xì)胞功能、分子功能和生物功能。并應(yīng)用ClusterProfileKEGG.R 工具包進(jìn)行KEGG Pathway 富集分析。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)當(dāng)歸湯活性成分篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫按照既定的篩選條件，去掉重復(fù)成分后獲得生物活性成分（83）個，表1。

2.2 CRC 的靶點(diǎn)篩選

通過檢索GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫得到CRC 的治療靶點(diǎn)，共得到8573 個CRC 的相關(guān)致病與治療基因。

2.3 活性成分與疾病共同靶點(diǎn)篩選

白術(shù)當(dāng)歸七物湯的83 個活性成分相關(guān)治療靶基因經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后（不能標(biāo)準(zhǔn)化的予以刪除）與CRC8573 個疾病靶點(diǎn)交集共178個，得到Venny 圖（圖1）。

圖1 白術(shù)當(dāng)歸七物湯活性成分靶基因與CRC 疾病基因交集Venn 圖

表1 白術(shù)當(dāng)歸湯7 味中藥TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選的生物活性成分

續(xù)表1

圖2 白術(shù)當(dāng)歸七物湯蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING 數(shù)據(jù)平臺中，輸入178 個共同靶點(diǎn)名稱，按照既定的檢索條件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），利用COUNT.R 插件統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)頻次前20 的蛋白靶點(diǎn)，出現(xiàn)頻次較高的AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、JUN、CASP3 蛋白靶點(diǎn)等，并繪制條形圖（圖3）。

圖3 白術(shù)當(dāng)歸七物湯治療CRC 相關(guān)的高頻蛋白靶點(diǎn)

2.5 白術(shù)當(dāng)歸七物湯活性成分-CRC-靶點(diǎn)互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.2 軟件在活性成分-CRC-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖中，共獲得255 個節(jié)點(diǎn)和1254 條邊（包括中間的疾病與藥物及關(guān)系）（圖4），其中紅色代表CRC，藍(lán)色代表藥物白術(shù)當(dāng)歸七物湯，紫色代表白術(shù)當(dāng)歸湯活性成分，黃色代表白術(shù)當(dāng)歸湯與CRC 的共同靶點(diǎn)。

圖4 白術(shù)當(dāng)歸湯的活性成分-CRC-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

利用R 軟件對178 個共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能分析得到的柱狀圖（圖5）、氣泡圖（圖6）及KEGG 富集結(jié)果（圖7）。本結(jié)果中共有42 個信號通路富集靶點(diǎn)數(shù)目大于等于20。通過分析，共同靶點(diǎn)主要分布在Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection（卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染）、Hepatitis B（乙型肝炎）、Human cytomegalovirus infection（人 巨 細(xì) 胞 病 毒 感 染）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號通路）、Fluid shear stress and atherosclerosis（脈沖剪切力與動脈粥樣硬化）等多條信號通路中。圖8 則基于卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路為例，顯示出白術(shù)當(dāng)歸七物湯治療CRC 的靶點(diǎn)。

3 討論

中草藥在CRC 輔助治療中越來越被廣泛應(yīng)用，它在改善癥狀、提高患者免疫能力等方面發(fā)揮了一定的作用。然而傳統(tǒng)的中草藥組方多為個體經(jīng)驗(yàn)，差異較大，因而常常無法客觀、有效地評估療效。組方之間的協(xié)同作用也無法提供更為科學(xué)的依據(jù)，其作用機(jī)制也無法系統(tǒng)研究，因而不被國際學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可與接受。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在“藥物成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，觀察藥物與疾病內(nèi)在關(guān)聯(lián)并分析多種藥物協(xié)同作用的一種方法[7]。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥復(fù)方的作用及其機(jī)制更為科學(xué)、系統(tǒng)，因而逐漸成為熱點(diǎn)。

圖5 GO 功能分析柱狀圖

圖6 GO 功能分析氣泡圖

圖7 KEGG 富集分析結(jié)果

圖8 白術(shù)當(dāng)歸七物湯作用于Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection 信號通路（紅色表示可能靶點(diǎn)）

CRC 屬于中醫(yī)的“積聚”“腸積”等范疇，常常表現(xiàn)為血便、腹痛、便秘、腹瀉。歷代醫(yī)家對其治療見解各異，如漢唐主張通絡(luò)去瘀，宋金則以痰瘀論治，明清時期醫(yī)家則是以瘀為主，并主張瀉下攻積等多法靈活運(yùn)用[8,9]。本方結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)思想，認(rèn)為CRC 仍癌毒發(fā)于內(nèi)，瘀結(jié)于臟胕，與多種病邪混合互結(jié)，致正氣消亡[3]，故以補(bǔ)益氣血，健脾養(yǎng)心的歸脾湯為基礎(chǔ)化裁而來。方中以黃芪、白術(shù)、甘草甘溫之品補(bǔ)脾益氣以生血，使氣旺而血生；當(dāng)歸、茯苓補(bǔ)血養(yǎng)心安神；木香辛香而散，理氣醒脾；蛇草抑癌消瘀。組方具有一定的綜合性。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析后獲得83 個活性成分，使得臨床白術(shù)當(dāng)歸七物湯的使用有了可供研究的基礎(chǔ)，也為后續(xù)在白術(shù)當(dāng)歸七物湯基礎(chǔ)上加減藥物治療CRC 提供了科學(xué)指導(dǎo)。

經(jīng)過將白術(shù)當(dāng)歸七物湯的83 個活性成分相關(guān)治療靶基因經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后獲得與CRC 相關(guān)的靶點(diǎn)共178 個，其中包括靶點(diǎn)為AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、JUN、CASP3 等，提示白術(shù)當(dāng)歸七物湯主要可能通過作用上述基因表達(dá)蛋白發(fā)揮抗腫瘤作用。

在獲得有效成分的基礎(chǔ)上，通過白術(shù)當(dāng)歸七物湯成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析觀察到，頻次較高的有AKT1（絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶）、IL-6（白細(xì)胞介素6）、VEGFA、MAPK3 等通路上的靶點(diǎn)。而GO 分析及KEGG 通路篩選顯示，共同靶點(diǎn)主要分布在Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Human cytomegalovirus infection、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis 等多條信號通路中。提示白術(shù)當(dāng)歸七物湯可通過AKT1、IL6、VEGFA、MAPK3 等多靶點(diǎn)、多通路、多途徑治療CRC，且白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、黃芪、木香、甘草、白藥蛇舌草治療CRC 具有協(xié)同作用。

AKT1 是一種絲氨酸/ 蘇氨酸激酶，是磷脂酰肌醇3- 激酶（PI3K）/AKT1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的主要作用靶點(diǎn)。AKT1 在CRC 的發(fā)生發(fā)展中，活化釋放細(xì)胞存活信號，通過磷酸化激活，抑制其下游的多種作用底物，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分化，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[10]。P13K/AKT 參與腫瘤血管生成的調(diào)控，促進(jìn)腫瘤血管的生成，并促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化學(xué)療法以及放射療法的抵抗性[11,12]。IL-6 是連接炎癥與腫瘤的關(guān)鍵炎癥因子[13]，并在多種腫瘤中異常表達(dá)[14]。而且通過參與多條信號通路如Janus 蛋白酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號通路，Ras 蛋白、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，以及PI3K/AKT 信號通路來調(diào)控腫瘤的生長、增殖、分化、轉(zhuǎn)移及侵襲[15]。有多項(xiàng)研究表明抑制IL-6 對多種腫瘤有治療效果[13,16-18]。血管內(nèi)皮生長（VEGF）是目前已知特異性最好、作用最強(qiáng)的促血管生成因子[19,20]。其中VEGFA 是其相關(guān)基因家族中在組織和細(xì)胞中含量最豐富、功能最強(qiáng)大的，在血管新生中起關(guān)鍵作用[19]。VEGF 可與其受體結(jié)合促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移，從而介導(dǎo)血管的生成[21]，對實(shí)體腫瘤的發(fā)生進(jìn)展有重要促進(jìn)作用[22]。

在我們的研究中，白術(shù)當(dāng)歸七物湯仍然是通過抑制腫瘤增殖轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)凋亡、抗血管生成等經(jīng)典通路發(fā)揮抗腫瘤作用，這與傳統(tǒng)的抗CRC 藥物如奧沙利鉑、5- 氟尿嘧啶（5-FU）、卡培他濱等藥物有相似之處。這一方面表明，使用白術(shù)當(dāng)歸七物湯治療CRC具有一定的科學(xué)根據(jù)，另一方面也為我們后續(xù)針對白術(shù)當(dāng)歸七物湯的藥物有效成分研究提供了基礎(chǔ)，有可能從中能提取抗CRC 的核心化合物而進(jìn)一步開發(fā)。

總之，白術(shù)當(dāng)歸七物湯是通過多靶點(diǎn)、多通路、多途徑治療CRC，且白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、黃芪、木香、甘草、白藥蛇舌草治療CRC具有協(xié)同作用。進(jìn)一步有待于從白術(shù)當(dāng)歸七物湯中篩選出最有效的化合物成分開發(fā)運(yùn)用。并在在此基礎(chǔ)上探索該藥物在肺癌、膀胱癌、胰腺癌及前列腺癌等惡性腫瘤中的療效。