楊敏，黃江菊，龍銳，李娟，駱文龍

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，重慶；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶）

0 引言

鼻黏膜分泌亢進(jìn)是鼻腔炎癥性疾病如急慢性鼻炎、鼻竇炎、過(guò)敏性鼻炎的主要特點(diǎn)之一。黏蛋白是一類高度糖基化的大分子蛋白，主要分為分泌型和膜結(jié)合型。MUC5AC 是人類氣道上皮細(xì)胞中重要的分泌型黏蛋白，是氣道黏液的主要成分之一。本課題組前期研究表明，MUC5AC 在體外培養(yǎng)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞炎癥模型中表達(dá)明顯升高[1]。苯環(huán)喹溴銨是一種M3 受體阻斷劑，這種選擇性抗膽堿藥能夠很好的抑制氣道炎癥[2,3]。本課題組成員前期已做了研究，證實(shí)BCQB 對(duì)大鼠變應(yīng)性鼻炎模型MUC5AC 具有很好的抑制作用[4]，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟趶娜祟惣?xì)胞水平探討B(tài)CQB對(duì)黏蛋白MUC5AC 表達(dá)的影響，從而為鼻腔炎癥性疾病提供新的藥物治療方案。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)所提取的標(biāo)本來(lái)源于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科鼻科組收治入院的鼻中隔偏曲和阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征患者，于鼻腔擴(kuò)容術(shù)或鼻中隔成型術(shù)中取得的無(wú)炎癥鉤突組織用于實(shí)驗(yàn)。患者無(wú)慢性鼻-鼻竇炎、真菌性鼻竇炎、過(guò)敏性鼻炎以及其他變態(tài)反應(yīng)性疾病史，取材近1 月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素及其他抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物，無(wú)手術(shù)外傷史。

1.2 藥品與主要試劑

胎 牛 血 清、DMEM/F12（1：1）培 養(yǎng) 基 購(gòu) 于 美 國(guó)Gibco 公司，表皮生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、全反式維甲酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鼠抗人單克隆抗體細(xì)胞角蛋白CK18、I 型膠原酶、核酸染料hoechst33258、組胺、苯環(huán)喹溴銨均購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司，青鏈霉素雙抗購(gòu)于中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)公司， ELISA 試劑盒購(gòu)于中國(guó)上海西塘生物公司，ECL 發(fā)光試劑盒購(gòu)于美國(guó)Millipore 公司，RNA 提取試劑盒Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 引物均購(gòu)于日本Takara 公司，胰島素及兩性霉素B 由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供。

1.3 鼻黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定

將術(shù)中取下的人鉤突組織經(jīng)分離，純化后先用血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后換成含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞接近匯合時(shí)進(jìn)行傳代。取第2 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。原代細(xì)胞培養(yǎng)近匯合時(shí)行免疫熒光檢測(cè)上皮細(xì)胞特異性抗原細(xì)胞角蛋白CK18 的表達(dá)。具體見(jiàn)本課題組前期研究[1]。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理

將鼻黏膜上皮細(xì)胞分成對(duì)照組（C）、組胺組（H）、苯環(huán)喹溴銨組（BCQB）、異丙托溴銨組（IB）。對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基；組胺組加入含組胺（10-4 mol·L-1）的無(wú)血清培養(yǎng)基，濃度選擇來(lái)源于王振霖的研究[5]；苯環(huán)喹溴銨組（BCQB）先加入含BCQB（10-6 mol·L-1）無(wú)血清培養(yǎng)基孵育30 分鐘后，再加入組胺（10-4 mol·L-1）；異丙托溴銨組（IB）先加入IB（10-6 mol·L-1）無(wú)血清培養(yǎng)基孵育30 分鐘后，再加入組胺（10-4 mol·L-1）。干預(yù)后各組放5% CO2 培養(yǎng)24 小時(shí)。

1.5 Real-time PCR 檢測(cè) MUC5AC mRNA 表達(dá)

提取細(xì)胞總RNA 后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用CFX96 熒光 定 量PCR 儀 檢 測(cè)MUC5AC mRNA 的 表 達(dá)。MUC5AC 上游 引 物5’-TACCAGTGCCAGTGTGTGTGC-3’，下 游 引 物5’-GCCATACACGGGCACAATCT-3’，擴(kuò)增片段大小為126bp；GAPDH 上游引物5’-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3’，下游引物5’-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’，擴(kuò)增片段大小為132bp。反應(yīng)體系為：模板1μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，SYBR 熒光酶5μl，DEPC 水3.2μl，共10μl。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，軟件自動(dòng)分析出MUC5AC mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 ELISA 法檢測(cè) MUC5AC 蛋白表達(dá)

收集各組上清液，2000 r·min-1，離心15 分鐘，采用雙抗夾心法定量檢測(cè)上清液中黏蛋白MUC5AC 的表達(dá)量，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光值（A）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將A 值換算成濃度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

人鼻黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果及免疫熒光鑒定可參照本課題組前期研究，在此不再贅述[1]。

2.1 Real-time PCR 檢測(cè)MUC5AC mRNA 表達(dá)

圖1 人鼻黏膜上皮細(xì)胞中MUC5AC mRNA 在各組中的表達(dá)

2.2 ELISA 檢測(cè)MUC5AC 蛋白表達(dá)

圖2 ELISA 檢測(cè)上清液中MUC5AC 蛋白表達(dá) (ng/mL)

3 討論

在人類氣道上皮中，黏液是一種由水和黏蛋白組成的復(fù)合分泌物[6]。這種黏液對(duì)于保護(hù)氣道免受外界環(huán)境侵害中起到重要作用。黏蛋白作為一種高度糖基化大分子蛋白，賦予黏液的物理學(xué)和生物學(xué)特性[7]。MUC5AC 是人類氣道上皮細(xì)胞中重要的分泌型黏蛋白，是氣道黏液的主要成分之一。已有研究表面MUC5AC 在體外培養(yǎng)的人鼻粘膜上皮細(xì)胞中表達(dá)升高[2]。組胺作為一種炎癥介質(zhì)，在鼻腔炎癥性疾病，尤其是過(guò)敏性鼻炎中表達(dá)明顯升高。王振霖等人的研究表明，組胺能夠刺激體外培養(yǎng)的人鼻粘膜上皮細(xì)胞高表達(dá)MUC5AC。本課題組成員的前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也以組胺作為誘導(dǎo)劑，成功制造大鼠變應(yīng)性鼻炎模型，在大鼠鼻黏膜中檢測(cè)到MUC5AC 高表達(dá)[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇組胺作為炎癥誘導(dǎo)劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，組胺能夠在細(xì)胞水平成功誘導(dǎo)人鼻粘膜上皮細(xì)胞高表達(dá)MUC5AC，由此證明組胺能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

劉維會(huì)課題組研究發(fā)現(xiàn)[8]， 溴化異丙托品，一種M 膽堿能受體拮抗劑，能夠顯著減少慢性支氣管炎大鼠模型支氣管肺泡灌洗液( BALF)、氣管培養(yǎng)液、上皮以及黏膜下的腺體細(xì)胞中黏蛋白的含量。Bos 等[9]的研究表明， M 受體拮抗藥噻托溴銨既能抑制過(guò)敏原誘導(dǎo)的黏液腺體增生，還能降低黏蛋白MUC5AC 基因表達(dá)水平。我們的前期研究表明M 受體拮抗劑能夠降低鼻黏膜上皮細(xì)胞MUC5AC 的表達(dá)[1]。由此表明，M 受體拮抗劑能夠降低氣道黏蛋白的表達(dá)，從而緩解氣道炎癥的高分泌現(xiàn)象。根據(jù)“同一氣道同一疾病，(one airway one disease)的”觀點(diǎn)[10]，上、下呼吸道在組織結(jié)構(gòu)上是延續(xù)的，具有高度相似性，且上、下氣道的各類疾病是也是密切相關(guān)的。M 受體拮抗劑可能通過(guò)下調(diào)上氣道MUC5AC 的表達(dá)對(duì)鼻腔炎癥性疾病的分泌亢進(jìn)起到抑制作用。

苯環(huán)喹溴銨是一種選擇性M3 受體拮抗劑，是我國(guó)自主研發(fā)的藥物，已獲得中國(guó)專利，有望成為氣道高分泌性疾病的治療新藥。本課題組的前期研究表明，苯環(huán)喹溴銨能夠改善大鼠變應(yīng)性鼻炎癥狀，抑制大鼠氣道MUC5AC 的表達(dá)[4]。我們的研究還提示苯環(huán)喹溴銨能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞MUC5AC 的表達(dá)[1]。在本研究中，我們?cè)隗w外細(xì)胞水平研究了苯環(huán)喹溴銨對(duì)組胺誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)黏蛋白MUC5AC的影響。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果中，組胺組黏蛋白基因MUC5AC mRNA 的表達(dá)與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），苯環(huán)喹溴銨組與組胺組相比，MUC5AC mRNA 的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示苯環(huán)喹溴銨能夠從核酸水平抑制組胺誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)MUC5AC。從ELISA 檢測(cè)結(jié)果看出，組胺組上清液中MUC5AC 蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且苯環(huán)喹溴銨組與組胺組相比，MUC5AC 蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示BCQB 能夠從蛋白水平抑制組胺誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)MUC5AC。結(jié)合PCR 和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們的研究表達(dá)，BCQB 能夠抑制組胺誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC 的表達(dá)。

綜上述，本研究提示，苯環(huán)喹溴銨能夠抑制組胺誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC 的表達(dá)，進(jìn)一步提示其有望成為鼻腔高分泌性疾病治療新藥。